Hsa-miR-498对肾上腺皮质癌细胞SW-13增殖及凋亡的影响△

赵欣　张学斌　李汉忠

中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院泌尿外科/北京协和转化医学中心，北京100730

Hsa-miR-498对肾上腺皮质癌细胞SW-13增殖及凋亡的影响△

赵欣张学斌#李汉忠

中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院泌尿外科/北京协和转化医学中心，北京100730

目的探索微小核糖核酸（micro RNA）Hsa-miR-498对肾上腺皮质癌细胞（SW-13）增殖及凋亡的影响，并初步预测其靶基因。方法将SW-13细胞分为3组，空白对照组（A组）为未接受转染细胞，阴性对照组（B组）为无意义寡聚核苷酸和LipofectamineTM2000转染试剂按1∶1混合转染，敲低组（C组）为转染Has-miR-498 inhibitor组。使用RT-PCR检测各组中Has-miR-498的表达情况；应用MTT法测定各组细胞的生长曲线；采用Annexin V-FITC/PI双染法检测各组细胞的凋亡率；并用miRDB初步预测与Hsa-miR-498相关的靶基因。结果经RT-PCR检测发现C组细胞中Hsa-miR-498表达下降；MTT结果显示，与A、B组相比，C组细胞增殖能力下降（P＜0.05）；Annexin V-FITC/PI双染法结果显示，A、B组相比，C组细胞凋亡率增加，但差异无统计意义（P＞0.05）。经miRDB初步预测Has-miR-498与细胞增殖及凋亡最相关的靶基因为CD93和JHDM1D。结论降低Hsa-miR-498在SW-13中的表达可抑制SW-13的增殖并促进其凋亡。表明Hsa-miR-498可能与SW-13的增殖及凋亡相关。

肾上腺皮质癌细胞；细胞增殖；细胞凋亡；微小核糖核酸-498

Oncol Prog，2016，14（6）

肾上腺皮质肿瘤（adrenalcortical tumor，ACT）是内分泌系统常见的肿瘤，尸检中发现率为7.3%。在引起肾上腺皮质醇症的肾上腺皮质肿瘤中，肾上腺皮质腺瘤占10%，肾上腺皮质癌（adrenalcortical carcinomas，ACC）占6%［1］。

微小RNA（micro RNA）是一种短链非编码RNA，它的主要作用为调控靶mRNA的表达，与多种疾病的发生发展密切相关。Hsa-miR-498位于19q13.41，研究表明，Hsa-miR-498在卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌等疾病起病中起重要作用［2-4］，尚无研究探索Hsa-miR-498在肾上腺皮质癌中的作用。本研究旨在初步探索Hsa-miR-498对肾上腺皮质癌细胞增殖及凋亡的影响。

1　材料与方法

1.1实验材料

肾上腺皮质癌细胞系SW-13（中国医学科学院细胞中心）。

主要试剂包括：L15培养基（中国医学科学院细胞中心）；胎牛血清（美国Gibco公司）；miR引物、U6引物（上海英俊生物技术有限公司）；miRNA Inhibitor套装（苏州吉玛生物技术公司）；LipofectamineTM2000转染试剂（美国Invitrogen公司）；MTT四甲基偶氮唑盐（美国Sigma公司）；Annexin V-FITC（美国Invitrogen公司）。经苏州吉玛生物技术公司设计合成相应的Has-miR-498 inhibitor。阴性对照无意义寡聚核苷酸序列为：5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3'。

主要仪器包括：细胞培养箱（美国Thermo Scientific Forma公司）；Eppendorf 5417c离心机（德国Eppendorf公司）；SMA4000分光光度计（北京Meriton公司）；流式细胞仪（美国Beckman Courlter公司）。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养及实验分组SW-13细胞培养于L15培养基中（含10%胎牛血清），置于37℃、无CO2环境的细胞培养箱中传代。取对数生长期细胞进行实验。分为3个实验组，每组细胞3个复孔，每孔3000～10000个细胞。其中A组为空白对照组，为未接受转染细胞。B组为阴性对照组，无意义寡聚核苷酸和LipofectamineTM2000转染试剂按1∶1混合。C组为转染Has-miR-498 inhibitor组，即敲低组。

1.2.2体外转染转染前24 h取对数生长期长势良好的SW-13细胞，以每孔3×103个细胞置于24孔培养板中，37℃，无CO2细胞培养箱中培养24 h。细胞融合达50%～60%时，将LipofectamineTM2000转染试剂盒Hsa-miR-498 inhibitor按1∶1混合，孵育15 min，加入24孔板中，6 h后更换培养液，培养24 h后重复转染一次，然后继续培养24 h。

1.2.3RT-PCR检测各组Has-miR-498的表达情况使用Trizol法提取各组细胞样本总RNA，以U6作为内参照进行校正和标准化。RT反应程序为16℃，30 min；42℃，42 min；85℃，5 min。RTPCR反应程序为95℃，5 min；95℃，10 s；60℃，20 s；72℃，20 s；反应40个循环。通过各组产物的标准曲线及熔解曲线，得到各反应管循环阈值Ct，应用GenePix ProV6.0进行数据分析。实验重复3次。定制的引物序列为：

Has-miR-498 RT Prime 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCG CACTGGATACGACGAAAAA-3' 5'-GCTTTCAAGCCAGGGGGCG-3' 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCG CACTGGATACGACAAAATATG-3' 5'-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3' U6 RT Prime

1.2.4MTT法检测3组细胞的生长曲线①接种细胞：用L15培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000～ 10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200 μl。②培养细胞：培养0 h、24 h、48 h、72 h、96 h。③显色：在0 h、24 h、48 h、72 h、96 h的相应时间点，每孔加MTT溶液（5 mg/ml用PBS配）20 μl继续孵育4 h，终止培养。每孔加150 μl DMSO，振荡10 min，使结晶物充分融解。④读取OD值：选择570 nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以0 h、24 h、48 h、72 h、96 h时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.2.5Annexin V-FITC/PI双染法检测3组细胞凋亡率①离心收集悬浮细胞，微量离心机转速2000 rpm，离心时间5 min，弃培养基。②用冷PBS洗涤细胞两次（2000 rpm，5 min，收集细胞）。③用400 μl 1×Binding Buffer悬浮细胞，浓度约为1×106/ml。④在细胞悬浮液中加入5 μl Annexin V-FITC，轻轻混匀后于2～8℃避光条件下孵育15 min。加入10 μl PI后轻轻混匀于2～8℃避光条件下孵育5 min。⑤在1 h内用流式细胞仪检测。

1.2.6Hsa-miR-498靶基因的初步预测经miRDB靶点预测工具（http://mirdb.org/miRDB/），对Hsa-miR-498靶基因进行初步预测。

1.3统计学方法

使用SPSS17.0软件处理数据。各组实验-均独立重复3次，实验数据采用均数±标准差（±s）表示。多组间数据比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验。当P＜0.05时差异有统计学意义。

2　结果

2.1RT-PCR检测结果

A、B、C组2-ΔΔCt值分别为（1.00±0.00）、（1.12± 0.15）和（0.46±0.11）。C组细胞中Has-miR-498表达明显低于A组和B组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2MTT法测定3组细胞的生长曲线

C组细胞在48 h、72 h和96 h增殖率（29.80%± 1.45%，37.67%±0.59%和45.1%±1.10%）低于A组（34.60%±3.47%，41.20%±0.78%，54.00%±1.59%）和B组（36.37%±1.15%，47.17%±2.55%，53.35%± 0.28%），差异均有统计学意义（P＜0.05）。（图1）

图1　3组细胞的生长曲线

2.3Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率

Hsa-miR-498在SW-13细胞中敲低后，A、B、C组细胞凋亡率分别为1.92%±0.82%，2.11%±0.76%和4.95%±0.81%，C组细胞凋亡率高于A、B组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4Hsa-miR-498靶点预测

经miRDB预测Hsa-miR-498有多个靶基因，包括PDK3、JHDM1D、CD93、NAP1L3、DCTN4、KCNK10、CCPG1等。发现其中与细胞增殖、凋亡、血管形成最相关的靶基因为JHDM1D和CD93。

3　讨论

Micro RNA具有复杂功能和调控途径。有研究提示Hsa-miR-498与散发三阴性乳腺癌的发病有关，在三阴性乳腺癌组织中表达明显上调，BRCA1为其靶基因，可能是一种癌基因［2］。Gopalan［4］的研究显示，Hsa-miR-498在结直肠癌组织中表达下调，能促进结直肠癌细胞增殖，与结直肠癌的发生有密切关系，可能是一种抑癌基因。有研究提示卵巢癌组织中Hsa-miR-498下调提示预后欠佳，其主要的靶基因为FOXO3［3，5］，可能是一种肿瘤抑制因子。Wang等［6］研究指出Hsa-miR-498在非小细胞肺癌中明显下调，并与疾病的进展有关。本研究中实验结果显示，Hsa-miR-498可促进肾上腺皮质癌细胞的增殖，具有部分癌基因特征，HsamiR-498表达敲低后，肾上腺皮质细胞增殖明显下降，因此可作为治疗肾上腺皮质肿瘤靶向药物的潜在靶点。但同时也应该关注将其用作靶向药物时带来的不良反应，尤其是导致其他组织肿瘤的发生，比如结直肠癌、卵巢癌等。

Hsa-miR-498有多个的靶点，经miRDB靶点预测工具发现其与肿瘤发生最相关的靶基因为JHDM1D和CD93［7-8］。这些靶基因有独特的细胞功能，比如细胞增殖、血管形成和凋亡等，为进一步探索Hsa-miR-498作用途径提供了线索。

本研究发现敲低肾上腺皮质癌细胞中的HsamiR-498后，肾上腺皮质癌细胞的增殖能力降低，提示Hsa-miR-498可促进肾上腺皮质癌细胞的增殖。但查阅文献目前尚无Hsa-miR-498在肾上腺皮质癌组织中表达上调的报道，因此Hsa-miR-498可能仅有促进肾上腺皮质癌细胞增殖的作用，有部分癌基因特征，这对理解肾上腺皮质肿瘤的发病提供了新的线索，但目前资料无法评价其促使肾上腺皮质细胞恶变的作用。进一步研究应检测其在肾上腺良性肿瘤及肾上腺皮质癌中的表达，以评价其与肾上腺皮质细胞增殖的关系，以及主要的靶基因和信号传导途径。

［1］Alan J，Wein LRAW.Campbell-Walsh Urology［M］.10th ed.Elsevier，2012:1693.

［2］Matamala N，Vargas MT，Gonzalez-Campora R，et al.MicroRNA deregulation in triple negative breast cancer reveals a role of miR-498 in regulating BRCA1 expression［J］.Oncotarget，2016，7（15）:20068-20079..

［3］Cong J，Liu R，Wang X，et al.Low miR-498 expression levels are associated with poor prognosis in ovarian cancer［J］. Eur Rev Med Pharmacol Sci，2015，19（24）:4762-4765.

［4］Gopalan V，Smith RA，Lam AK.Downregulation of microRNA-498 in colorectal cancers and its cellular effects［J］.Exp Cell Res，2015，330（2）:423-428.

［5］Liu R，Liu F，Li L，et al.MiR-498 regulated FOXO3 expression and inhibited the proliferation of human ovarian cancer cells［J］.Biomed Pharmacother，2015，72:52-57.

［6］Wang M，Zhang Q，Wang J，et al.MicroRNA-498 is downregulated in non-small cell lung cancer and correlates with tumor progression［J］.J Cancer Res Ther，2015，11（Suppl）: C107-C111.

［7］Nawrocki MJ，Strugala AJ，Piotrowski P，et al.JHDM1D and HDAC1-3 mRNA expression levels in peripheral blood mononuclear cells of patients with systemic lupus erythematosus［J］.Z Rheumatol，2015，74（10）:902-910.

［8］Galvagni F，Nardi F，Maida M，et al.CD93 and dystroglycan cooperation in human endothelial cell adhesion and migration adhesion and migration［J］.Oncotarget，2016，7（9）: 10090-10103.

The effect of Hsa-miR-498 on proliferation and apoptosis of human adrenal cortical carcinoma cell line SW-13△

ZHAO Xin ZHANG Xue-bin#LI Han-zhong
Department of Urology/Translational Medicine Center，Peking Union Medical College Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100730，China

ObjectiveTo investigate the effect of Hsa-miR-498 on proliferation and apoptosis of human adrenal cortical carcinoma cell line SW-13，and try to determine the target genes.MethodThe cell line was divided into three groups，including blank group（group A），negative control（NC）group（group B），and inhibitor group（group C），with no transfection，transfection of oligonucleotide and LipofectamineTM2000 transfection reagent（1∶1），and transfection of Has-miR-498 inhibitors，respectively.RT-PCR was applied to determine the expression of the Has-miR-498 in each group；then the proliferation was tested by MTT and the apoptosis by Annexin V-FITC/PI.The target genes of Hsa-miR-498 were predicted using miRDB.ResultRT-PCR showed that Has-miR-498 was knocked down in group C；MTT showed that，compared with group A and group B，proliferation slowed in group C；And in Annexin V-FITC/PI，it was found that knocking down Hsa-miR-498 could mildly promote apoptosis of SW-13 cells，though no statistically significant difference was observed（P＞0.05）.By miRDB analysis，CD93 and JHDM1D were most probably related to the proliferation and apoptosis of SW-13 cell line.ConclusionKnocking down Hsa-miR-498 could reduce proliferation and mildly promote apoptosis of SW-13 cells，suggesting a correlation between them.

adrenocortical carcinoma cell；cell proliferation；cell apoptosis；Has-miR-498

R736.6

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.06.11

2016-04-19）

国家自然科学基金（81070628）

（corresponding author），邮箱：xuebinzh@126.com