酒精性肝病患者肝组织cyp2e-3基因水平变化

王转国，付强，乐永红，庄小芳，王宏峰

酒精性肝病患者肝组织cyp2e-3基因水平变化

王转国，付强，乐永红，庄小芳，王宏峰

目的探讨细胞色素cyp2e-3基因在酒精性肝病（ALD）发病中的作用。方法选择2013年2月至2015年2月我院收治的ALD患者126例，按照病程分为A组40例（患病时间在1年以内）、B组43例（患病时间在1～3年）和C组43例（患病时间在3年以上），选择同期来我院健康体检的健康人121例作为对照。常规行肝活检，采用荧光定量PCR技术检测肝组织cyp2e-3基因水平，采用酶联免疫吸附法检测血清cyp2e-3蛋白水平，采用Western blotting法和免疫组织化学染色法检测肝组织cyp2e-3蛋白表达情况。结果ALD患者肝组织cyp2e-3基因水平（34.8±1.7）显著高于对照组【（6.6±0.7，P＜0.05】；经过ELISA法检测，发现与正常人相比，不同组ALD患者血清cyp2e-3水平显著升高；经Western-blotting法检测，发现与正常人比，不同组ALD患者肝组织cyp2e-3水平显著升高；随着患病时间的延长，肝组织cyp2e-3基因表达量逐渐升高，cyp2e-3蛋白主要集中在肝细胞膜处表达，主要特征为大小不均匀的棕黄色小颗粒。结论酒精性肝病患者肝组织和血清cyp2e-3水平显著升高，因此推断cyp2e-3基因的激活可能在一定程度上促进了酒精性肝病的发生。

酒精性肝病；cyp2e-3基因；基因表达

过量饮酒问题已经成为世界性的公共卫生问题［1］。Boccia S et al［2］相关研究表明，长期过量饮酒导致体内乙醇等化学物质含量过高不仅会损伤生殖细胞，同时可在一定程度上损伤肝脏细胞，促使肝细胞发生脂肪变性［3］、坏死，这一现象的持续恶化将会最终导致肝纤维化［4］和肝硬化［5］。Kang JW et al［6］认为酒精性肝病（Alcoholic liver disease，ALD）成因较多，其发病不仅受到环境因素的影响，同时也受到遗传因素的制约。由于饮食习惯的差异，ALD在西方国家较为常见，但是随着我国国民经济的发展和人们生活方式的改变，ALD发病率在我国也逐年升高，目前已经成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病［7］。Song BJ［8］研究表明乙醇诱导肝细胞色素cyp2e-3基因属于亚铁血红素类蛋白质超家族酶系，在人体可以参与对内、外部物质的代谢活动。cyp2e-3基因主要在肝脏微小体表达，并可启动微粒体的乙醇氧化途径。因此，对于乙醇的代谢至关重要［9，10］。我们对cyp2e-3基因与酒精性肝病发病之间相互关系进行了初步研究，以期揭示该基因的作用，为酒精性肝病的防治提供一定的理论和实验依据。

1　资料与方法

1.1研究对象选择我院2013年2月至2015年2月收治的ALD患者126例作为研究对象，男性86例，女性40例；平均年龄（45.7±5.4）岁。按照病程将其分为A组、B组和C组，其病程分别为1年以内40例、1～3年43例，3年以上43例。ALD诊断根据《酒精性肝病诊断标准》进行，排除患有其它肝脏疾病，例如乙型肝炎、肝硬化以及肝癌患者。选择同期正常人121例，78例，女性43例；平均年龄（43.5±6.8）岁。两组在性别和年龄方面均无明显差异（P＞0.05）。

1.2肝组织cyp2e-3检测常规行肝穿刺，将肝组织标本立即保存于液氮中，用于蛋白提取和RNA抽提。采用ABI Stepone Plus检测cyp2e-3基因mRNA水平，相关引物由上海生物工程有限公司合成。从液氮中取出冻存的肝组织0.1g，在冰上溶化，加入RNA Plus 0.45 ml，在预冷的研钵中将组织研碎，移入1.5 ml EP管中。在研钵中，加入RNA Plus 0.45 ml，洗涤后转入离心管；向离心管中加入氯仿200 μl，剧烈震荡15 s，冰上静置15 min；12000 r/m 4℃离心15 min；将上清转移到无RNase的EP管中，加入等量异丙醇，颠倒混匀后冰上静置10 min；12000 r/m 4℃离心10 min；弃上清，加入75%乙醇750 μl，轻轻混匀，12000 r/m 4℃离心10 min；弃上清，尽量去除残留乙醇；加入适量去RNase水，测定提取RNA质量，剩余用于反转录。根据NCBI提供的cyp2e-3基因序列，设计引物如下：F：5'-CCAAGTTCAAAGCGCT-3'；R：5'-AAAAGACCAAAGGCCAGCC-3'。按照TAKARA说明书进行荧光定量PCR操作。

1.3血清cyp2e-3水平检测采用ELISA法（瑞士Roche公司）［11］，抗cyp2e-3购于Acris公司（德国）。取cyp2e-3蛋白标准品（购自Roche公司），加Dilution Buffer，行1：50稀释，绘制标准曲线。取血清，行1：200稀释，每孔加入待检血清100μl，加入检测液50μl，室温孵育2 h，加入TMB显色底物，在495 nm处测定吸光度值。根据标准曲线，计算待测样品cyp2e-3蛋白水平。

1.4肝组织cyp2e-3蛋白水平检测采用Westernblotting法，取肝组织，按照Thermo公司蛋白提取试剂盒说明书进行蛋白提取［12］。Western-blotting操作方法参照《分子克隆手册》进行。采用链霉素亲和过氧化物酶（S-P）法对正常人和ALD患者肝组织常规进行抗体孵育以及染色。免疫组织化学染色结果评判标准如下［13］：膜染色＜10%或者无染色判定为阴性；仅有细胞膜被染色或者＞10%细胞可以观察到膜染色则为阳性（+）；＞30%细胞呈现出中等染色则判定为++；＞50%细胞表现出较强的完全膜染色则判定为+++。

1.5统计学分析应用SPSS 20.0统计软件对获得的数据进行处理。计量资料以（±s）表示，采用t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2　结果

2.1正常人与ALD患者肝组织cyp2e-3 mRNA水平比较通过RT-PCR技术检测不同样本中cyp2e-3基因mRNA水平，选用GAPDH基因作为内参，结果如图1所示，与对健康人比，ALD患者肝组织cyp2e-3基因水平（34.8±1.7）显著高于对照组（6.6±0.7），两者之间存在显著性差异（P＜0.05）。

图1　正常人与ALD患者肝组织cyp2e-3基因mRNA水平比较

2.2正常人与ALD患者血清cyp2e-3c比较经过ELISA法检测，发现与正常人相比，不同组ALD患者血清cyp2e-3水平显著升高（图2）。

图2　正常人与ALD患者血清cyp2e-3蛋白水平比较

2.3正常人与ALD患者肝组织cyp2e-3c比较经Western-blotting法检测，发现与正常人比，不同组ALD患者肝组织cyp2e-3水平显著升高（图3）。

图3　正常人与ALD患者肝组织cyp2e-3蛋白表达量比较A：正常人；B：A组ALD；C：B组ALD；D：C组ALD

2.4肝组织cyp2e-3蛋白表达情况经免疫组化检测，ALD患者肝组织cyp2e-3表达阳性染色主要集中在肝细胞膜，其主要的特征为大小不均匀的棕黄色小颗粒，而在正常人肝组织中未见其阳性染色，说明酒精性肝病患者肝组织cyp2e-3表达增高（图4）。

图4　正常人与ALD患者肝组织cyp2e-3蛋白表达情况深蓝色为肝组织细胞cyp2e-3表达3+，浅蓝色为cyp2e-3阳性1+，蓝色越深说明肝组织cyp2e-3表达量越高

3　讨论

酒精性肝病是由于长期大量饮酒所引起的肝脏疾病，初期主要表现为脂肪肝，随着病情的发展出现酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化，甚至导致肝功能衰竭而死亡。因此，对于酒精性肝病的诊治和预防十分重要。目前，酒精性脂肪肝的发病机制尚不清楚，但是相关研究表明酒精性脂肪肝是由多基因与环境因素共同作用导致的。Cantor［14］研究结果表明定位于人体第10号染色体上的cyp2e-3基因被证明与酒精性脂肪肝发病相关，进一步研究结果表明CYP2E-3蛋白分子量为56.9 KD，其在机体内参与诸多氧化还原反应过程，例如cyp2e-3基因可以作为人体内代谢醇类物质的主要酶系［15］。谢瑞莲等［16］研究结果表明，cyp2e-3基因可以催化的底物多达75种，而在这当中大部分前体物质均表现出一定的致癌性或者潜在的毒物性质。因此，cyp2e-3基因对于机体内部有害物质的代谢至关重要。迪吉等［17］研究表明cyp2e-3系统约占乙醇代谢能力的15%左右，而且可以在一定条件下被激活，而乙醇在人体内代谢速率的快慢在一定程度上可以反映出一个人酒量的大小。因此，目前有些学者认为cyp2e-3基因代谢通路与酒量大小之间存在一定的相关性。相关文献表明［18］大量饮酒、食用腌制、油炸、烟熏食品在一定程度上可以促进机体内部cyp2e-3基因表达量的升高，即cyp2e-3基因的表达因多种危险环境因素的诱导而增加。Reddy VD et al［19］相关研究结果表明，cyp2e-3基因在人体内代谢乙醇的过程中会产生大量的自由基，而过多的自由基能在一定程度上对肝脏部位的膜结构造成损伤，引起肝脏中相关细胞的氧化还原反应。因此，cyp2e-3基因在酒精性肝病的发病过程中起到了关键的作用。但是，目前对于cyp2e-3基因与酒精性肝病之间相互关系的研究鲜见报道。因此，探究cyp2e-3基因与酒精性肝病之间相互关系对于揭示酒精性肝病发病机制以及后期治疗均具有重要的现实意义。

本研究结果表明，酒精性肝病患者肝组织cyp2e-3基因水平和蛋白表达量均显著高于健康人，并且通过对不同酒精性肝病病程患者肝组织cyp2e-3基因表达量的测定发现，随着患者患病时间的延长，cyp2e-3基因表达量更高，说明cyp2e-3基因与酒精性肝病患病之间存在相关性，即cyp2e-3基因的过表达参与了酒精性肝病的发生发展。

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（收稿：2016-01-02）

（本文编辑：陈从新）

Hepatic cyp2e-3 gene expression in patients with alcohol liver disease

Wang Zhuanguo，Fu Qiang，Le Yonghong，etal.
DepartmentofLiverDiseases，ChineseMedicineHospital，Urumqi830000，XinjiangUygur Autonomous Region，China

To explore the relationship between cyp2e-3 gene expression and alcoholic liver disease. MethodsIn the present study，we recruited 126 patients with alcohol liver disease（ALD）in our hospital from February 2013 to February 2015，and the patients were divided into group A（n=40，with the disease history less than one year），group B（n=43，with the disease history one to three years），and group C（n=43，with the disease history greater than three years）.We selected 121 healthy subjects at the same period for control.The hepatic cyp2e-3 mRNA was detected by quantitative PCR，serum cyp2e-3 levels were assayed by ELISA，and hepatic cyp2e-3 expression were detected by Western-blottingor stained immunohistochemistry.ResultsThe hepatic cyp2e-3 mRNA levels in patients with ALD were（34.8±1.7），much higher than【（6.6±0.7，P<0.05】in healthy persons；serum cyp2e-3 levels in patients with ALD were higher than in control too；Western-blotting and SP detection found that cyp2e-3 expression in liver tissues in group A，group B，and group C were much stronger than in healthy persons as no cyp2e-3 expression were found in the latter hepatic tissues.ConclusionThe activated expression of cyp2e-3 gene in liver tissues in patients with ALD might play a role in the occurrence of liver disease，and it warrants further study.

Alcoholic liver disease；cyp2e-3 gene；Expression

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.05.013

830000乌鲁木齐新疆维吾尔自治区中医院肝病科

王转国，男，32岁，硕士研究生，主治医师。E-mail：254528425@qq.com

王宏峰，E-mail1xjwlmqwhf@sina.cn