银黄清肺胶囊化学成分的LC-ESI-MS/MS分析

汪　丹，蔡　甜，吴志军，蒋学华

（1.四川大学华西药学院，四川成都610041；2.成都大学医学院，四川成都610106；3.中国科学院成都生物所，四川成都610041）

银黄清肺胶囊化学成分的LC-ESI-MS/MS分析

汪丹1，2，蔡甜3，吴志军3，蒋学华1

（1.四川大学华西药学院，四川成都610041；2.成都大学医学院，四川成都610106；3.中国科学院成都生物所，四川成都610041）

研究液质联用技术对银黄清肺胶囊化学成分的分析。对银黄清肺胶囊提取物进行LC-MS分析，确定分子式，鉴定出部分质谱峰的结构。共发现36种化合物，其中有蔗糖、尿苷、2，3-二脱氧尿苷、没食子酸、奎尼酸、新绿原酸、表没食子儿茶素、原儿茶酸、莽草酸、阿魏酸、咖啡酸、反式阿魏酸、犬尿喹啉酸、羟基苯甲酸、4-甲氧基芥子酸、山奈酚、异鼠李素、大黄素18种未在正离子模式下的液质联用文献中报道过。复方中药的有效成分LC-MS检测,正离子模式适用于检测大多数杂原子化合物，负离子模式更适用于含羧基、多羟基的化合物（如酚酸、多酚类、部分黄酮和苷类）的检测，为银黄清肺胶囊进一步质量研究及检测方法选择提供理化依据。

银黄清肺胶囊；LC-ESI-MS；酚酸；黄酮

0　引　言

银黄清肺胶囊是由14味中药制成的用于清肺化痰、止咳平喘的复方中药制剂，其组成药材有北葶苈子、麻黄（炙）、苦杏仁、浙贝母、枇杷叶、大青叶、石菖蒲、穿山龙、一只蒿、银杏叶、五味子、枳实、生石膏、甘草[1]。它的名称易与银黄制剂[2-3]（由金银花和黄芩提取物制成）混淆，两者药理作用不同，后者主治急性扁桃体炎及上呼吸道感染。现有研究中，周卿意骏等[4]使用HPLC-Q-TOF-MS/MS的技术，在正离子模式下鉴定出了其中54个成分，并尝试建立了10批次药材中14个成分的指纹图谱[1]，但是活性成分中的含羧酸、酚酸基团的组分及部分黄酮、苷类等在正离子模式下响应较弱，不易被检测，更适合在负离子模式下进行测定。

1　实验部分

1.1仪器与试剂

Agilent 1100型高效液相色谱仪配G1315B-DAD检测器（美国Agilent科技有限公司）；micrOTOF-Q质谱仪（德国Bruker公司）；AUX120型万分之一电子天平（日本岛津公司）；AFZ-1001-U型艾科浦超纯水系统（美国艾科浦国际有限公司）。

银黄清肺胶囊样品批号131003（湖南安邦制药有限公司的独家品种）；甲醇为色谱级（Fisher ScientificPittsburgh，PA，USA）；绿原酸、阿魏酸、对香豆酸、槲皮素、芦丁、异鼠李素、大黄素、表没食子儿茶素、儿茶素、咖啡酸、没食子酸标准品购于四川省维克奇生物科技有限公司,含量＞98%。山奈酚、3，4-二羟基苯甲酸（原儿茶酸）标准品购于成都瑞芬思生物科技有限公司，含量＞98%。

1.2实验方法

1.2.1样品及空白对照液的制备

样品溶液：取银黄清肺胶囊，抖出内容物，精密称定0.15g，置于1.5mL带盖的玻璃试剂瓶中，精密量取甲醇600 μL，密封浸渍2 h后，超声15 min，吸取试液，于12000r/min离心10min，取上清液进样。

空白对照液：按上述方法，不加药物，制备空白对照液。

1.2.2分析条件

液相色谱条件：色谱柱：Inertsil ODS-4（250mm× 4.6mm×5μm，GL sciences Inc）；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）和甲醇（B），梯度洗脱，洗脱程序如下：0～2 min，10%B；2～5 min，10%～50%B；5～15 min，50%～100%B；15～25 min，100%B；柱温30℃，进样量15 μL，流量0.8 mL/min，用三通管分流后连接质谱进样。

质谱条件：离子源为ESI源；在负离子条件下检测，End Plate Offset-500V；Capillary，3 500V；氦气作为碰撞气体，高纯度氮气作为雾化和干燥气体，流量为6L/min，压力为1.0bar（1bar=105Pa），干燥气温度180℃。数据采集范围50～1500m/z。质量数据使用Bruker数据分析4.0版软件处理。预试后，选择12eV作为MS2的主要碰撞能，对于12eV打不碎的山奈酚、大黄素，设为20eV。

2　结果与讨论

采用LC-MS技术，可获得各质谱峰的MS信息，利用Bruker数据分析4.0版软件，可获得化合物的可能分子式信息，再依据化合物的MS2碎片信息进行交叉对比，最终可确定该质谱峰的分子式。同时通过与对照品的保留时间和同条件下的碎片信息比较，或与ESI离子源的其他文献信息进行对比后，最终可鉴定部分化合物的结构。

2.1与其他检测方法比较的优势

由图1可知，LC-MS的离子流图虽然也和HPLC的图类似，但是各化合物不必完全分离开，只要化合物的分子量不同即使同时出峰，也不影响采集和辨识，故采集时间大大的缩短。而Q-TOF MS比QQQ MS的分辨率更高，可以采集到小数点后四位，避免分子量相近的离子峰相互混淆，故适用于鉴定复杂混合物的化学组分的结构。

图1　银黄清肺胶囊的Base Peak Chromatogram离子流图

2.2负离子模式下的检测结果与讨论

实验共检测到银黄清肺胶囊提取物在负离子条件下的133组MS2碎片信息，筛除空白背景峰、裂解碎片再次碎裂后的信息，对比对照品或文献，共鉴定出26个化合物（质谱信息见表1）。其中，蔗糖、尿苷、2，3-二脱氧尿苷、没食子酸、奎尼酸、新绿原酸、表没食子儿茶素、原儿茶酸、莽草酸、阿魏酸、咖啡酸、反式阿魏酸、犬尿喹啉酸、羟基苯甲酸、4-甲氧基芥子酸、山奈酚、异鼠李素、大黄素18种化合物在正离子模式下的LC-MS[4]中未被报道。

表1　化合物1～26质谱信息1）

糖类：

化合物1，分子式为C12H22O12，依据其有179的碎片以及C6H10O6的中性丢失，推测结构为两个六碳糖相连，根据文献[5]推断为蔗糖。

核苷类：

化合物2，依据碎片信息和N规则，推测分子式中应含N元素，故推测其分子式为C9H12N2O6，结合中性丢失和文献[6-7]后确定为尿苷（尿嘧啶核苷）。同理化合物3的分子式为C9H12N2O4，结合碎片及中性丢失，推断为2，3-二脱氧尿苷。

酸类：

化合物4分子式为C7H6O5，经与没食子酸标准品对比，保留时间、MS2碎片均一致，确定为没食子酸。同理，与标准品对比保留时间、MS2碎片、中性丢失发现：化合物8与原儿茶酸，化合物12与阿魏酸，化合物13与咖啡酸均一致，分别鉴定化合物8、化合物12、化合物13为原儿茶酸、阿魏酸和咖啡酸。化合物16与化合物12的碎片相似，鉴定为反式阿魏酸。

化合物5、6、9，其分子式分别为C7H12O6，C16H18O9，C16H18O9。其中化合物6，9碎片峰相似，为同分异构体，经与绿原酸标准品对比后发现，化合物9为绿原酸，依据文献[2]报道结合保留时间，化合物6为新绿原酸。而化合物5的碎片信息与绿原酸中191碎片的MS3一致，故为奎尼酸。

化合物7的分子式为C15H14O7。在按[M-H]-分子量m/z 305.0667+0.01提取离子流时发现，得到3个质荷比相似的物质峰，其保留时间分别为9.2，9.8，10.5min。进一步分析各自的碎片结构发现，保留时间为10.5min的化合物含有硫元素，分子式不一致，保留时间9.2min的化合物碎片与标准品不符，只有保留时间为9.8min的MS2碎片与表中没食子儿茶素标准品一致。故鉴定保留时间9.8min的峰为表中没食子儿茶素，其余两个峰因无标准品或相关文献未鉴定出结构。

化合物11、18、19的分子式分别为C7H12O5、C7H6O3、C12H14O5，由不饱和度推断，三者均具有苯环结构。由碎片推断，化合物11含有羧基和邻羟基结构，再依据文献[8]，故推断为莽草酸。化合物18，依据其有CO2的中性丢失，推测具有羧基，同时具有羟基，根据文献报道其含有对羟基苯甲酸和间羟基苯甲酸，与文献报道也是一致的。故化合物18应为羟基苯甲酸，但其所含羟基是在对位还是间位，由于未与标准品对比暂无法确定。同理，化合物19与化合物18同样具有羧基和苯环结构，与文献[6，9]对比后推断为4-甲氧基芥子酸

黄酮及黄酮苷类：

依据化合物的分子式、分子量、碎片特征和保留时间与标准品对比，鉴定化合物20、23、24、26分别为槲皮素、山奈酚、异鼠李素、大黄素[4，8，10]。与文献[4]对比MS，MS2信息，鉴定化合物15、21、22、25分别为甘草苷、柚皮素、橙皮素、刺芒柄花素。

需要注意的是，化合物23及山奈酚标准品在LC-MS实验中的碎片相同，但与山奈酚标准品直接质谱进样所得的碎片有不同，多出了m/z 223，239，241等峰度较大的碎片峰。进一步观察图谱发现，LC-MS实验中的化合物23和LC-MS实验中山奈酚标准品的m/z 285.0390的峰附近同时还有一个m/z 285.17的背景峰（出峰时间15～18min，碎片 223，239，241）。由于仪器在选择碰撞时，最小的选择m/z范围为X+0.5，在同时出峰的情况下无法区分开 m/z 285.039和m/z 285.17，故带来了碎片干扰。调整实验条件，将碰撞能量增大为20eV后，山奈酚的碎片峰丰度增加，再筛除掉285.17的碎片峰m/z 223，239， 241后，化合物23可观察到与标准品山奈酚直接质谱进样相同的碎片，进一步确定化合物23为山奈酚。其他同样需要20eV碰撞能才能较好碎裂的物质还有化合物26大黄素。

其他：

化合物10的分子式为C20H27NO11，其碎片与文献[4，11]中苦杏仁苷的报道一致，故确定为苦杏仁苷。

此外检测到分子式为C11H12O5的化合物，但实验得到碎片结构和文献中提到的葶苈子的化学成分已报道[4，9]的芥子酸有差异，未鉴定出结构。除此之外还检测到多组含硫元素或磺酸基[4，12]的化合物，但其具体结构还需要进一步研究确定。

2.3与正离子模式下文献的检测结果对比

考虑到负离子下不易出峰的化合物，在负离子模式下的Q-TOF-MS的检测限相对较高，有可能某些检测到的物质峰由于峰强较低，无法得到MS2碎片，影响鉴定结构。为方便日后建立银黄清肺胶囊中更多峰的指纹图谱，故对银黄清肺胶囊正离子模式下已报道的化合物，在负离子模式下，进行相应的离子流提取（m/z X+0.01%），通过其精确分子量、Err（10-6）、mSigma值（同位数比值）确定分子式，结合文献对比得到以下10种化合物[4]，如表2所示。

表2　化合物28～37 HPLC-ESI-Q-TOF信息

表中除化合物27、31和36以外，其余化合物的误差均小于5×10-6，符合准确确定分子式的要求。

分析化合物27、化合物31、化合物36误差偏大的原因：在浓度接近检测限时，化合物的准确质量采集可能出现相对较大的偏差。化合物27推断为文献[4]中所报道的Pranone（分子式为C6H6O4），其实测值与理论值m/z相差0.002 0，低于Q-TOF仪器m/z X+0.003的系统误差，只不过由于其理论分子量较小（141.0193），算出来的相对误差（10-6）偏大。同理，化合物31、36推断为文献[4]中所报道的枳层苷、一枝蒿酮酸，其相对误差均小于10×10-6。

据文献报道，样品中可能含[M-H]-的m/z 609的黄酮苷化合物有橙皮苷、新橙皮苷和芦丁3种。化合物28依据其准确分子量和分子式推断为文献[4]中所报道的橙皮苷。化合物29有新橙皮苷和芦丁两种可能，且新橙皮苷和芦丁为同分异构体，分子式相同。进一步用芦丁标准品进行实验比较，芦丁的保留时间为12.6 min，与化合物29不一致，故推断化合物29为新橙皮苷。

化合物30依据测得的分子式可能为麻黄或伪麻黄碱这一对异构体中的一种，但是比较文献中的保留时间，因三者的极性差异，在反相柱中的出峰顺序为麻黄碱先于Pranone，伪麻黄碱最后出峰，故推断化合物30为伪麻黄碱。

化合物32～35由5×10-6以内得到的分子式与文献对比推断为苦鬼臼毒素、木犀草素、苷菜苯丙呋喃、甘草查尔酮B[4，8，10-11]。

由上述结果可知，大部分正离子模式的文献中检测到的含杂原子的离子峰在负离子模式下响应较弱，不利于检测。而负离子模式下也采集到18种在正离子模式下不易出峰的酚类或黄酮类化合物。正负离子模式下物质峰有较明显差异。

3　结束语

本研究建立了银黄清肺胶囊中复杂成分的简易、快速的LC-MSn分析方法，能够同时实现多组分的良好分离并提供各峰的组成和结构信息，共找到了36种化合物，其中有蔗糖、尿苷、2，3-二脱氧尿苷、没食子酸、奎尼酸、新绿原酸、表没食子儿茶素、原儿茶酸、莽草酸、阿魏酸、咖啡酸、反式阿魏酸、犬尿喹啉酸、羟基苯甲酸、4-甲氧基芥子酸、山奈酚、异鼠李素、大黄素18种未在正离子模式下的文献中报道。由实验和文献对比可知，正负离子模式下出峰的物质差异较大，复方中药的有效成分LC-MS检测,正离子模式适用于检测大多数含杂原子的化合物，而负离子模式更适用于含羧基、多羟基的化合物（如酚酸、多酚类、部分黄酮和苷类）的检测，应同时关注两种测试条件下的结果才完整。本文为银黄清肺胶囊的质量研究及检测方法的合理选择奠定了基础。

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（编辑：徐柳）

LC-ESI-MS/MS analysis of chemical constituents in Yinhuang Qingfei capsule

WANG Dan1，2，CAI Tian3，WU Zhijun3，JIANG Xuehua1
（1.West China School of Pharmacy，Sichuan University，Chengdu 610041，China；2.School of Medicine and Nursing，Chengdu University，Chengdu 610106，China；3.Chengdu Institute of Biology，Chinese Academy of Sciences，Chengdu 610041，China）

To analyze chemical constituents of Yinhuang Qingfei capsules by HPLC-ESI-Q-TOFMSMS method.The extracts of Yinhuang Qingfei capsules are analyzed with LC-MS method to determine molecular formula and identify the structures of partial spectral peak.36 compounds are found，including sucrose，uridine，2，3-deoxyuridine，gallic acid，quinic acid，Neochlorogenic acid，（-）-Epigallocatechin，protocatechuic acid，shikimic acid，ferulic acid，caffeic acid，trans ferulicacid， kynurenicacid， Hydroxybenzoicacid， 4-methoxy-erucicacid， kaempferol，isorhamnetin，Emodin，18 components that are not reported in HLPC-MS literatures under the positive ion mode.In LC-MS detection of active ingredients in compound traditional Chinese medicine，the positive ion mode can be applied to detect most hetero atomic compounds while the，negative ion mode is more suitable to detect carboxyl-containing and polyhydroxy compounds（such as phenolic acid，polyphenol，flavonoid and glycoside）.This paper has laid a foundation for further studying and testing the quality of Yinhuang Qingfei capsules.

Yinhuang Qingfei capsules；LC-ESI-MS；phenolic acids；flavonoids

A

1674-5124（2016）03-0036-05

10.11857/j.issn.1674-5124.2016.03.009

2015-10-18；

2015-12-08

国家自然科学基金青年项目（21305137）

汪丹（1983-），女，四川成都市人，硕士研究生，专业方向为临床药学及药物MS分析。