奥沙利铂黄芩素联合应用对胃癌细胞抑制作用的影响研究

杨丛莲

(攀枝花市中西医结合医院，四川 攀枝花　617000)



奥沙利铂黄芩素联合应用对胃癌细胞抑制作用的影响研究

杨丛莲

(攀枝花市中西医结合医院，四川 攀枝花617000)

目的观察奥沙利铂与黄芩素联用对人胃癌细胞株SGC-7901的抑制作用.方法实验分为对照组、给药组(奥沙利铂组、黄芩素组、联合作用组).应用MTT法测定给药组不同给药浓度对胃癌SGC-7901细胞株增殖的影响；倒置显微镜下观察对照组、给药组培养48 h后的细胞形态学变化；应用流式细胞术检测对照组、给药组胃癌SGC-7901细胞株凋亡率；HOE33258染色观察细胞凋亡形态学改变.结果奥沙利铂组、黄芩素组、联合作用组均可有效抑制SGC-7901细胞增殖，呈明显的量效关系；其中联合作用组抑制率明显高于奥沙利铂组和黄芩素组，差异具有显著统计学意义(P<0.01).奥沙利铂组、黄芩素组SGC-7901细胞凋亡率明显高于对照组，差异具有显著统计学意义(P<0.05).联合作用组细胞凋亡率明显高于对照组、奥沙利铂组、黄芩素组，差异具有显著统计学意义(P<0.05).结论奥沙利铂与黄芩素联用可显著抑制人胃癌细胞株SGC-7901细胞增殖，诱导细胞凋亡.

奥沙利铂；黄芩素；胃癌；细胞增殖

【引用格式】杨丛莲.奥沙利铂联合应用对胃癌细胞抑制作用的影响研究[J].北华大学学报(自然科学版)，2016，17(5)：640-643.

奥沙利铂是第三代铂类化合物，是目前治疗胃癌的一线药，但对晚期胃癌患者治疗有效率也仅为40%～50%[1].如何提升奥沙利铂抗胃癌细胞的敏感性，以增强化疗效果，延长患者生存期是临床面临的挑战.黄芩素是从传统中药黄芩中提取的一种主要成分，具有抗氧化、保护神经、调节免疫等作用，其体外抗肿瘤细胞活性已得到实验证实[2].但目前关于奥沙利铂与黄芩素联合治疗胃癌的疗效仍未得到共识.本实验通过观察奥沙利铂与黄芩素联合应用抑制胃癌SGC-7901细胞株增殖、诱导凋亡的作用，以期为胃癌临床治疗提供实验依据.

1　材料与方法

1.1细胞与主要试剂

人胃癌细胞系SGC-7901为温州医科大学附属第三医院中心实验室传代保存.奥沙利铂注射液(江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H20000337)；黄芩素(上海信裕生物科技公司)；1640细胞培养液、胎牛血清、MTT(美国Sigma公司)；双染法细胞凋亡检测试剂盒(上海博谷生物科技有限公司).

1.2细胞生长抑制试验(MTT法)

实验分为对照组、给药组(奥沙利铂组、黄芩素组、联合作用组).人胃癌细胞制成浓度为5×104个/mL的细胞悬液，100 μL/孔接种在96孔板中，放入CO2孵箱中培养.24 h后给空白对照组中加入20 μL细胞完全培养基；奥沙利铂组、黄芩素组中每孔分别加入20 μL含不同浓度对应药物的细胞完全培养基，奥沙利铂的终浓度分别为1.25，2.5，5，10，20 μmol/L，黄芩素的终浓度分别为2.5，5，10，20，40 μmol/L，联合作用组每种药浓缩一倍后各加10 μL.上述每个浓度均设置5个复孔，继续培养24，48，72 h后，每孔加入MTT(5 mg/mL) 20 μL，继续培养4 h，弃上清，每孔加150 μL DMSO，振荡5 min，490 nm处测定每孔的吸光度(OD值)，计算抑制率.

1.3细胞增殖形态学观察

取人胃癌细胞制成浓度为5×104个/mL的细胞悬液，2 mL/孔接种于预先铺上无菌盖玻片的6孔板中，放入CO2孵箱中培养24 h后加入药物.对照组中加入20 μL细胞完全培养基,奥沙利铂组终浓度为10 μmol/L，黄芩素终浓度为20 μmol/L，联合作用组分别加入奥沙利铂、黄芩素10，20 μmol/L.培养48 h后取出培养板中的盖玻片，弃去细胞培养液后加 1 mL固定液，放置10 min，磷酸盐缓冲液冲洗2～3遍，在倒置显微镜下观察细胞形态学变化.

1.4诱导细胞凋亡检测与形态学观察

凋亡情况检测：操作与分组同1.3，培养48 h，0.25%胰酶消化后离心收集细胞，磷酸盐缓冲液重悬并计数.取1×106/孔重悬细胞，离心去上清后，采用PI双染法联合流式细胞仪检测细胞凋亡情况.形态学观察：在6孔板中铺上无菌盖玻片，之后操作与分组同1.3.培养48 h后取出培养板中的盖玻片，弃去培养液，加1 mL固定液放置10 min，磷酸盐缓冲液冲洗2～3遍，加入HOE33258染色液作用5 min，弃去染色液后用磷酸盐缓冲液冲洗2～3遍，载玻片上滴加1滴抗荧光淬灭PVP封片液，盖上贴有细胞的盖玻片，置于荧光显微镜下观察细胞凋亡形态.

1.5统计学处理

2　结　　果

2.1给药组SGC-7901细胞生长抑制情况

MTT检测显示：奥沙利铂组、黄芩素组、联合作用组均可有效抑制SGC-7901细胞增殖，呈明显的量效关系；其中联合作用组抑制率明显高于奥沙利铂组和黄芩素组，差异具有显著统计学意义(P<0.01).见表1.

表1给药后24，48，72 h对SGC-7901细胞生长抑制情况

注：与奥沙利铂组、黄芩素组相比，*：P<0.01

2.2各组SGC-7901细胞增殖形态变化

加药前对照组与实验组SGC-7901细胞数量和形态基本一致；给药组培养48 h后，可见细胞数量明显减少，细胞大小不一，形态不规则，高倍镜可见细胞核固缩、胞质减少以及胞质内出现空泡，部分细胞脱壁呈半悬浮状态.其中奥沙利铂联合黄芩素组细胞数量明显少于空白对照组、奥沙利铂组、黄芩素组.见图1.

2.3流式细胞仪检测各组SGC-7901细胞凋亡率

奥沙利铂组、黄芩素组SGC-7901细胞凋亡率分别为(47.42±0.45)%、(41.21±0.40)%，明显高于对照组的(7.44±0.23)%，差异具有显著统计学意义(P<0.05).联合作用组细胞凋亡率为(82.52±0.55)%，明显高于对照组、奥沙利铂组、黄芩素组，差异具有显著统计学意义(P<0.05).

2.4各组SGC-7901细胞凋亡的形态学观察

荧光显微镜下观察显示：正常细胞的细胞核为弥散性均匀分布的蓝色，凋亡细胞的细胞核为致密深蓝色或碎块状，颜色偏白.在奥沙利铂组、黄芩素组、联合作用组中均可见凋亡细胞，其中以联合作用组最为明显.见图2.

3　讨　　论

黄芩素是从天然植物黄芩中提取的一种黄酮类化合物，对白血病、乳腺癌、消化道肿瘤具有预防和治疗作用，其具有毒副反应较小、疗效好等优点，为肿瘤药物治疗提供了新思路，受到了临床的广泛关注[3-4].第三代铂类药物奥沙利铂是目前临床抗胃癌一线药物，但其对胃癌细胞的敏感性仍不理想，如何提升奥沙利铂抗胃癌细胞敏感性，改善患者化疗效果是该领域关注的焦点.目前，对奥沙利铂与黄芩素联合用于胃癌治疗尚处于探索阶段，对其抗胃癌细胞的疗效仍未得到最终证实.

本次研究中体外培养胃癌SGC-7901细胞，从抑制胃癌SGC-7901细胞株增殖、诱导凋亡两个方面观察奥沙利铂与黄芩素联用对胃癌细胞的抑制效果.结果显示：联合用药对胃癌SGC-7901细胞株增殖有明显的抑制作用，且效果明显优于奥沙利铂、黄芩素单独给药，并呈现出明显的量效关系，说明奥沙利铂与黄芩素在抗胃癌细胞增殖方面具有协同作用.诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡的结果显示：联合作用组细胞凋亡率明显高于奥沙利铂、黄芩素单独给药，且细胞凋亡形态学观察也显示：联合作用组细胞多为致密深蓝色或碎块状，说明奥沙利铂与黄芩素联用可明显增强诱导胃癌细胞凋亡的活性，抑制癌细胞增长.黄芩素可提升奥沙利铂抗胃癌细胞效果的可能机制为：1)黄芩素直接作用于癌细胞凋亡相关蛋白和基因[5]；2)黄芩素经线粒体途径或抑制COX-2来发挥抗癌细胞增殖效果[6]；3)黄芩素抑制磷酸化IKB形成，进而降低IL-6，XIAP 基因表达，激活Caspase3，Caspase9活性，抑制癌细胞增殖[7]；4)黄芩素可作为12-LOX特异性抑制剂发挥抗癌细胞活性[8].黄芩素提升黄芩素抗胃癌细胞敏感性的确切机制仍需要进一步研究证实.

综上所述，黄芩素作为抗癌新药可有效抑制胃癌SGC-7901细胞增殖、诱导细胞凋亡，与奥沙利铂具有明显协同作用，可有效提升奥沙利铂抗胃癌细胞活性，但真正应用于临床仍需要作用机制方面的深入研究.

[1] Mao Z Y，Guo X C，Su D，etal.Retrospective evaluation of the efficacy of first-line treatment of advanced gastric cancer with docetaxel and oxaliplatin[J].Cancer Invest，2015，33(1)：16-21.

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【责任编辑：陈丽华】

Influence of Baicalein Combined with Oxaliplatin on the Proliferation of Human Gastric Carcinoma Cells

Yang Conglian

(Panzhihua Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine,Panzhihua 617000,China)

Objective To observe the inhibitory effect of oxaliplatin combined with baicalein on human gastric cancer cell line SGC-7901.Method Control group and drug-treated groups (oxaliplatin group，baicalin group，and combined baicalin and oxaliplatin group) were set in this experiment.MTT assay was used to determine the effects of drugs at different concentrations on the proliferation of SGC-7901 cell line in the drug-treated groups；cell morphological changes of the cells cultured for 48h in the control and drug-treated groups were observed under an inverted microscope；apoptosis rates of gastric carcinoma cell line SGC-7901 cells were detected by flow cytometry in the control and the drug-treated groups；HOE33258 staining was used to observe morphological changes of the apoptosis.Results The proliferation of SGC-7901 cells in oxaliplatin group，baicalein group，and combined baicalin and oxaliplatin groups could be effectively inhibited，showing an obvious dose-response relationship；the inhibition rate in the combined baicalin and oxaliplatin groups was significantly higher than that in oxaliplatin group and baicalin group，with significant differences (P<0.01).The apoptosis rate of SGC-7901 cells in oxaliplatin group and baicalin group were significantly higher than that in the control group (P<0.05).The apoptosis rate in the combined baicalin and oxaliplatin groups was significantly higher than that in the control group，oxaliplatin group，and baicalin group (P<0.05).Conclusion Oxaliplatin combined with baicalein can inhibit the proliferation of human gastric cancer cell line SGC-7901 cells and induce the cell apoptosis.

Oxaliplatin；Baicalein；gastric cancer；cell proliferation

1009-4822(2016)05-0640-04

10.11713/j.issn.1009-4822.2016.05.018

2016-02-23

四川省卫生厅科研课题(110583).

杨丛莲(1969-)，女，副主任护师，主要从事外科学研究，E-mail：guttana@163.com.

R735.2

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