大鼠精索静脉曲张对睾丸生精细胞Cx43表达的影响

刘国霖，张泽敏，唐圆圆，滕晓明，2

(1.潍坊医学院生殖医学中心，山东 潍坊　261053；2.上海市第一妇婴保健院，上海　200040)



大鼠精索静脉曲张对睾丸生精细胞Cx43表达的影响

刘国霖1，张泽敏1，唐圆圆1，滕晓明1，2

(1.潍坊医学院生殖医学中心，山东 潍坊261053；2.上海市第一妇婴保健院，上海200040)

目的探讨精索静脉曲张(VC)对青春期大鼠睾丸生精细胞Cx43的影响.方法部分结扎大鼠左肾静脉,建立精索静脉曲张模型.取雄性SD大鼠30只，随机分为2组，每组15只，分为对照组、精索静脉曲张组(手术组)，每组中再分为3个亚组，每组5只，结扎持续时间为2,4,8周；达到相应的时间段后取各组大鼠左侧的睾丸，运用RT-PCR法检测Cx43及HIF-1α基因的表达，并在8周时通过Western-blot法检测Cx43及bcl-2蛋白表达水平.结果对照组在2,4,6周时Cx43及HIF-1α基因表达无明显变化；手术组在2,4,6周时HIF-1α基因表达水平提高，Cx43基因表达水平下降，与对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)；蛋白检测结果表明：8周时手术组Cx43及bcl-2蛋白表达水平显著下降.结论精索静脉曲张可致大鼠睾丸组织缺氧，Cx43及bcl-2表达下调，并诱导睾丸组织生精细胞凋亡增加，进而影响睾丸生精功能.

精索静脉曲张；Cx43；bcl-2；HIF-1α

【引用格式】刘国霖，张泽敏，唐圆圆，等.大鼠精索静脉曲张对睾丸生精细胞Cx43表达的影响[J].北华大学学报(自然科学版)，2016，17(5)：624-627.

精索静脉曲张(VC)是导致不育的主要原因之一，流行病学调查显示：VC在人群中发病率高达10%～15%，以左侧发病为多[1].缝隙连接(gap junction，GJ)具有传递各组细胞之间重要信号及物质交换的功能，广泛的存在与哺乳动物中.睾丸组织中GJ 通道主要由缝隙连接蛋白43(Cx43)构成[2]，该蛋白在心、脑组织中的病理生理机制已有较为全面的研究，但与睾丸生精功能的相关性仍鲜有报道.本研究建立在大鼠精索静脉曲张的动物模型的基础上，观察精索静脉曲张对Cx43，HIF-1及Bcl-2表达状况的影响，为探讨精索静脉曲张对睾丸功能的影响提供参考.

1　材料与方法

1.1建模与分组

选择鼠龄6周、体质量110 ～ 130 g的SD雄性大鼠作为青春期大鼠(潍坊医学院实验动物中心提供).腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，取腹正中切口，暴露并游离左肾静脉，放置一根直径为0.55 mm的金属杆(自制)，左肾静脉同时结扎，使其直径减少约50%.结扎后拔出金属杆，可见部分结扎的左肾静脉快速扩张，缝合切口.对照组大鼠游离左肾静脉，不结扎；以精索静脉最大径大于1 mm、左肾无缺血萎缩为造模成功标准.

1.2主要试剂与仪器

DMEM培养基(低糖)(美国HYClone)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；Cx43单克隆抗体(Sigma公司)；羊抗鼠IgG二抗(Sigma公司)；BCA蛋白定量分析试剂盒(Thermo，美国) DMIRE2型全自动倒置相差显微镜(Leica，德国)；DM5000B型研究型显微镜(Leica，德国)；超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；KA-1000型低速离心机(郑州南北仪器设备公司)；ECL发光仪(美国)；反转录试剂盒(abm公司)，RT-PCR试剂盒(日本Takara公司).

1.3支持细胞分离、培养及鉴定的方法

用眼科剪将睾丸实质剪成约1 mm3碎块，加入适量0.25%胰蛋白酶，并置于37 ℃摇床中震荡消化20 min，血清终止消化，1 000 r/min离心5 min后重悬细胞，再次以1 000 r/min离心5 min，在37 ℃摇床中用0.1%胶原酶Ⅳ震荡消化20 min，100目网筛过滤，800 r/min离心5 min后重悬细胞；并种植于75 cm2细胞培养瓶中(5%CO2，37 ℃)中培养.

1.4运用Fas-L法鉴定细胞

将细胞接种于6孔板中培养48 h，低渗处理固定于85%的乙醇中，用3%H2O2处理玻片后，将玻片置于拘椽酸/拘椽酸钠混合溶液中沸煮3 min，修复抗原.3%羊血清处理组织切片，置于孵箱中15 min，吸取剩余血清，加入50 μL一抗，37 ℃孵化1 h，磷酸缓冲液冲洗2次，5 min/次，加入生物素标记的二抗，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗5 min×2次，滴加SABC，37 ℃孵育30 min，磷酸缓冲液冲洗10 min，DAB显色，显微镜视野下观察，至显色清晰时蒸馏水冲洗终止反应，中性树胶封片.

1.5荧光定量PCR技术检测基因表达

TRIZOL法提取RNA，按照试剂盒进行反转录，按照RT-PCR试剂盒检测Cx43及HIF-1基因表达情况.引物序列见表1.

表1　引物序列

1.6Western-blot法检测蛋白表达

收集适量的睾丸组织加入100 μL裂解匀浆30 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清分装于无菌EP 管中，加入适量缓冲液，混匀，加热变性，行SDS-PAGE 凝胶电泳，湿法转移至PVDF膜上.室温下用5%脱脂牛奶的TBST封闭2 h，封闭液1/1 000 稀释一抗体，将膜与一抗置孵育袋中，4 ℃孵育过夜，用封闭液稀释按1∶1 000 稀释二抗体，室温下孵育2 h.TBST洗膜3次，10 min/次.化学发光检测试剂反应2 min，甩去多余液体，保鲜膜包好PVDF膜，暗室中感光、显影、定影一抗体.

1.7统计学分析

2　结　　果

分离得到的细胞培养48 h后行Fas-L染色.鉴定结果见图1.

在不同的时间段内运用RT-PCR法检测Cx43基因表达情况见表1.结果显示：对照组中Cx43基因表达水平随着时间的延长基本无变化，手术组中Cx43基因表达水平随着结扎时间的延长呈下降的趋势，两组比较差异具有统计学意义(P<0.05).

表2　Cx43基因达情况

注：与对照组比较，在不同的时间段内，*：P<0.05，#：P<0.05，﹠：P<0.05

在不同的时间段内运用RT-PCR法检测HIF-1α基因表达情况见表2.结果显示：对照组中HIF-1α基因随着时间延长其表达水平基本无变化，手术组中HIF-1α表达水平随着结扎时间的延长呈现增加的趋势，两组间比较差异具有显著统计学意义(P<0.05).

表3　HIF-1α表达情况

注：与对照组比较，在不同的时间段内，*：P<0.05，#：P<0.05，﹠：P<0.05

Western-blot法检测Cx43，bcl-2蛋白表达水平见图2，3.8周时手术组Cx43蛋白表达显著下降，bcl-2蛋白表达在手术后8周也显著下降.

3　讨　　论

精索静脉曲张(VC)是男性不育的一个主要原因，目前，其病理生理机制仍未明确，组织缺氧可能是其中的机制之一，但也有研究表明：不能明确VC会导致组织缺氧[3].缺氧诱导因子-1(HIF-1)作为缺氧诱导的主要转录因子之一，含两个亚单位(α，β)，其中HIF-1α是可调控的功能单位，主要通过氧浓度改变进行调节，在缺氧环境下可提升其转录活性，而HIF-1β在细胞核中连续表达，不受外界氧浓度影响.bcl-2蛋白质家族是控制线粒体致凋亡因子释放的主要调节因子[4]，在无死亡信号刺激时，bcl-2抗凋亡蛋白一般作为细胞器膜的整合膜蛋白被隔离起来，而促凋亡蛋白则以非活性的形式定位分布于胞质[5]，当细胞受到凋亡刺激，抗凋亡因子可接受磷酸化、蛋白水解等修饰调节[6].相关研究显示：HIF-1α是组织缺氧标志物之一[7]，bcl-2基因是组织凋亡的标志之一，可抑制细胞凋亡.

本实验发现：HIF-1α在对照组中的不同时间段内其表达无明显的变化.在手术组中HIF-1α表达在不同的时间段内呈增加的趋势，从第2周时开始增高，到第8周时达到高峰；同时在第8周通过Western-blot法检查bcl-2蛋白的表达水平发现：与对照组相比，手术组中bcl-2蛋白表达明显低于对照组.提示随着静脉曲张时间的延长，组织缺氧会逐渐的加重，进而会导致Bcl-2蛋白表达水平下降，失去抑制凋亡的功能，导致静脉曲张时睾丸生精细胞凋亡增多，造成睾丸生精功能下降.Helton等[8]研究发现：敲除大脑HIF-1α基因后可降低凋亡基因表达，减少缺氧大脑细胞凋亡.而HIF -1α可通过调节Bcl-2和Bax基因的表达，发挥条件调节凋亡过程的作用.随着VC 持续，HIF-1α表达持续增加，Bcl-2蛋白表达下降.

缝隙连接通道的主要成分是连接蛋白(Cx)，目前已发现的Cx蛋白家族多达20种，但其在不同的器官、组织中具有不同的分布特点[9].Cx43 蛋白是睾丸中表达最丰富的连接蛋白，存在于睾丸间质细胞之间、睾丸支持细胞之间以及睾丸支持细胞和生殖细胞之间，对维持血-睾屏障的完整性、支持细胞的增殖和分化及精子发生过程发挥重要作用[10].

Junja等[11]建立了缺失Cx43基因的小鼠模型，发现这些小鼠在出生后不久就死于心脏畸形，不过在睾丸组织中仍然能够发现原始生精细胞，但数量减少了50%以上，提示Cx43参与了胎鼠精原细胞增殖分化的调控.将缺乏的突变胎鼠的睾丸移植到成年雄鼠的肾包囊内，即使有正常的雄激素刺激，精子仍出现异常.Sridharan等[12]选择性的敲除支持细胞中Cx43基因，这样小鼠可以避免严重的畸形而死亡，但是在睾丸组织中仅存在少量生精细胞，并且不能分化成熟.国内研究[13]报道，睾丸畸形扭转造成的缺血缺氧能够抑制Cx43的表达，运用牛磺酸后能够上调Cx43的表达，保护睾丸组织.

本实验结果表明：对照组中Cx43基因在不同的时间段内其表达水平无明显变化.在手术组中Cx43在不同的时间段内其表达水平呈明显下降趋势，两组间具有明显的统计学差异，与HIF-1α基因表达呈现相反的影响，即随着静脉曲张时间的延长，手术组中HIF-1α基因表达增加，Cx43基因表达下降，暗示了Cx43基因表达可能与组织缺氧相关，组织缺氧越严重，其表达水平就下降显著.在第8周时通过检测Cx43蛋白的表达发现，与对照组相比，手术组蛋白表达显著下降，与HIF-1α基因、Cx43基因表达相对应，进一步证实Cx43的表达与组织缺氧相关.本研究亦存在一定的不足之处，即没有连续的测定每一周中bcl-2，Cx43，HIF-1α蛋白的表达水平，其远期效果是否也具有同样的作用还需要进一步研究.

综上所述，VC可使HIF-1α表达增加，进而导致组织缺氧，而随着静脉曲张时间进展，HIF-1α表达持续增加，进而下调bcl-2和Cx43基因表达水平，并降低睾丸组织抑制凋亡的功能，影响睾丸的生精功能，这些实验结果对今后在临床中如何保护睾丸生精功能提供一定参考.

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【责任编辑：陈丽华】

Effect of Varicocele on the Cx43 Expression in Rats’Testis Spermatogenic Cells

Liu Guolin1，Zhang Zemin1，Tang Yuanyuan1，Teng Xiaoming1，2

(1.Reproductive Medicine Center of Weifang Medical College，Weifang 261053，China；2.No.1MaternityHospitalofShanghai，Shanghai200040，China)

Objective To study the effect of experimental varicocele on the Cx43 expression in adolescent rats’ testis spermatogenic cells.Method A rat varicocele model was built by partially ligating the rat’s left renal vein.30 Male with SD rats were randomly divided into 2 groups,control group and varicocele group (surgery group)，15 rats in each group，and then each group was further divided into three sub-groups，5 rats in each sub-group；the ligation lasted for 2 weeks，4 weeks and 8 weeks，respectively；at the corresponding time points，the left testis of rats in each group were removed，then RT-PCR was applied to detect the Cx43 and HIF-1α gene expressions，and on week 8，the Cx43 and bcl-2 protein levels were detected by Western-blot assay Cx43.Results In the control group，there was no significant change in Cx43 and HIF-1α gene expression at the different time points，and in the surgical group，the HIF-1α gene expression was increased and the Cx43 gene expression was decreased，showing statistically significant differences compared with those in the control group (P<0.05)；protein assay results showed that Cx43 and bcl-2 protein expressions were significantly decreased on week 8 in the surgical group.Conclusion Varicocele can cause the hypoxia in rat testis，the expression of Cx43 and bcl-2 down-regulate，and induce the apoptosis of the testis spermatogenic cells，thereby affecting the spermatogenesis of rats’ testes.

varicocele；Connexion43；Bcl-2；HIF-1α

1009-4822(2016)05-0624-04

10.11713/j.issn.1009-4822.2016.05.014

2016-04-16

山东省自然科学基金重点项目(2014HZ003)；上海市市级医院适宜技术项目(SHDC12014223).

刘国霖(1988-)，男，主治医师，主要从事生殖医学研究，E-mail：lgl19881027@126.com；通信作者：滕晓明(1966-)，男，教授，主任医师，主要从事生殖医学研究,E-mail：txm196607wf@126.com.

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