QuEChERS净化超高效液相色谱-串联质谱法检测莲雾中4种杀菌剂

乐 渊*， 张 群， 刘春华， 吴南村

(中国热带农业科学院分析测试中心/海南省热带果蔬产品质量安全重点实验室，海南海口 571101)

莲雾(Syzygiumsamarangense(Blume) Merr.et Perry)是桃金娘科蒲桃属热带常绿果树，其果实具有特殊的芳香，肉质清脆可口。莲雾主要分布在我国台湾、海南、广东和福建等热带亚热带地区[1，2]。由于热带地区高温高湿的气候特点，且莲雾果皮薄、果肉组织幼嫩，导致莲雾很容易发生病害[3，4]。

氟硅唑、戊唑醇、抑霉唑和烯唑醇都是内吸性杀菌剂，在莲雾种植过程中常用于防治如炭疽病、黑腐病、疫病、黑星病、斑点病等病害。但不合理使用可能会造成在莲雾果实中农药残留超标，引发农产品质量安全问题。目前，国内外已有报道利用气相色谱法检测氟硅唑、烯唑醇和液相色谱法检测戊唑醇等，但这些方法往往前处理繁琐、测定时间长、检出限也较高，且尚未见有报道同时检测莲雾中氟硅唑、戊唑醇、抑霉唑和烯唑醇等四种杀菌剂[5 - 9]。由于莲雾保鲜能力差、不耐储存，室温下只能保存一周左右，因此在莲雾质量安全监测中急需快速、高通量的检测方法，减少果农因等待检测结果而导致的果品损耗。本研究利用QuEChERS(Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged and Safe)方法净化莲雾提取液，采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)检测，方法简便快速、准确度高，可用于莲雾中氟硅唑、戊唑醇、抑霉唑和烯唑醇等四种杀菌剂的测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

ACQUITY UPLC/Quattro PremierTMXE超高效液相色谱-串联四极杆质谱仪(美国，Waters公司)， 配有电喷雾离子源(ESI)和MasslynxTM4.0 工作站；电子分析天平(瑞典，梅特勒托利多公司)；离心机(上海安亭科学仪器厂)。

氟硅唑、戊唑醇、抑霉唑和烯唑醇标准品购自农业部环境保护科研监测所；甲醇、乙腈为色谱纯，购自美国Fisher公司；乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)吸附剂购自美国Agilent公司；C18吸附剂、石墨化炭黑(GCB)粉末购自上海安谱科学仪器有限公司；实验用水为Milli-Q超纯水。

莲雾样品购自海南省海口市南北水果批发市场。

1.2 标准溶液的配制

将氟硅唑、戊唑醇、抑霉唑和烯唑醇标准品用甲醇配制成浓度为 100 μg/mL的混合标准储备液，在-18 ℃ 避光保存，有效期3个月。取空白莲雾样品按1.3方法进行前处理，得到空白莲雾基质溶液，然后将上述标准储备液分别用甲醇和空白莲雾基质溶液稀释成质量浓度为5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0 ng/mL的系列混合标准溶液，现配现用。

1.3 样品前处理

莲雾样品经去核取可食部分，用组织捣碎机捣碎，装入洁净容器内，密封并于-18 ℃下保存。准确称取20.00 g均质试样于50 mL具塞离心管中，加入20.0 mL乙腈、6 g MgSO4、1.0 g NaCl后，高速(18 000 r/min)均质1 min，再以5 000 r/min离心5 min。取上层乙腈溶液6.0 mL于预先加有200 mg PSA、200 mg C18及1 000 mg MgSO4的离心管中，涡旋60 s，再以5 000 r/min离心5 min，取1 mL上清液过0.22 μm微孔滤膜，待UPLC-MS/MS分析。

1.4 仪器工作条件

1.4.1UPLC工作条件ACQUITY-UPLCTMBEH C18柱(100×2.1 mm,1.7 μm；美国Waters公司)；流动相A为甲醇，流动相B为1 mmol/L乙酸铵溶液；梯度洗脱程序：0～1.50 min,10%～70%A;1.50～5.50 min,70%～70%A;5.50～6.00 min,70%～90%A;6.00～6.50 min,90%～90%A;6.50～6.60 min,90%～70%A;6.60～7.00 min,70%～10%A;7.00～8.50 min,10%～10%A。流速：0.25 mL/min；柱温：35 ℃；进样体积：5 μL。

1.4.2ESI-MS/MS工作条件正离子电离模式；毛细管电压3.00 kV；脱溶剂气温度350 ℃；脱溶剂气流量900 L/h；锥孔气流量50 L/h；离子源温度110 ℃；碰撞气流速0.21 mL/min。多反应监测模式(MRM)下的质谱参数见表1。

表1 MRM 分析的质谱参数

* quantitative ion.

2 结果与讨论

2.1 UPLC-MS/MS工作条件的优化

在电喷雾离子源电离模式下，以流动注射方式分别对氟硅唑、戊唑醇、抑霉唑和烯唑醇的单标溶液进行母离子全扫描，再对各自的子离子进行全扫描，每个化合物选择2对响应值高的特征离子对作为定量及定性离子对，并进行MRM参数的优化，优化结果见表2。

在本文色谱条件下，以甲醇和1 mmol/L乙酸铵溶液作为流动相，氟硅唑、戊唑醇、抑霉唑和烯唑醇可获得较好的分离度及较高的响应值。图1为各杀菌剂浓度为50 ng/mL标准溶液的MRM色谱图。

图1 标准溶液的MRM色谱图(50 ng/mL)Fig.1 MRM chromatogram of the standard solution(the concentration is 50 ng/mL)

2.2 净化条件的选择

QuEChERS方法采用乙腈提取，MgSO4和NaCl盐析，无水MgSO4和PSA分散固相萃取净化[10]。QuEChERS方法具有回收率高、速度快、操作简单、可分析的农药范围广等优点，但净化能力较弱。为了提高净化能力，研究人员在寻找更多吸附剂以不断改进该方法。除PSA外，还常用C18粉、GCB、氨丙基粉等作吸附剂[11 - 13]。PSA能去除强极性的有机酸、酚类，部分去除糖和脂类基质干扰物，C18可以去除非极性的糖类、脂类等基质干扰物，GCB能去除基质中的色素。本实验尝试了使用PSA、PSA+GCB、C18、C18+GCB、PSA+C18、PSA+C18+GCB等条件来净化莲雾提取液，各条件下四种杀菌剂回收率见图2。结果表明添加有GCB的吸附剂，烯唑醇的回收率低于60%。PSA+C18、PSA、C18三种条件下，四种农药的回收率在70%～115%之间。单独使用PSA或C18粉末作吸附剂，净化液呈乳白色，使用PSA+C18作吸附剂，净化液澄清透明，说明PSA+C18作吸附剂净化效果较好。因此本文采用PSA+C18作吸附剂来净化莲雾提取液。

图2 不同净化条件下4种杀菌剂的回收率Fig.2 Recovery of the four fungicides in different cleaning conditions

2.3 方法的线性范围和检出限

移取一定量的各农药标准溶液，以空白莲雾基质提取液为稀释溶液配制标准曲线系列，采用1.4中方法进行测定，以仪器响应峰面积(y)对各目标农药的质量浓度(x)进行线性回归。结果表明，氟硅唑、戊唑醇、抑霉唑和烯唑醇的质量浓度在5.0～500.0 ng/mL 范围内线性良好，相关系数和回归方程见表2。

表2 氟硅唑、戊唑醇、抑霉唑和烯唑醇的线性回归方程、相关系数和线性范围

以信噪比(S/N)=3计，方法中烯唑醇、戊唑醇、氟硅唑和抑霉唑的检出限(LOD)为0.71、0.30、0.63和0.80 μg/kg。以S/N=10计，方法中烯唑醇、戊唑醇、氟硅唑和抑霉唑的定量限(LOQ)为2.3、1.1、2.0和2.5 μg/kg。

2.4 方法的精密度和回收率

取空白莲雾样品，按2.5、5.0、50.0 μg/kg 3个水平进行加入回收实验，按1.3方法进行前处理，平行测定5次，计算回收率和精密度。结果(表3)显示，四种杀菌剂的回收率在79.2%～122% 之间，相对标准偏差(RSD)在1.4%～9.0% 之间，符合方法学要求。

表3 方法回收率及相对标准偏差(n=5)

2.5 基质效应

本文通过测定各农药在基质匹配溶液中的响应值(A)及其在纯溶剂中的响应值(B)，得到基质效应(Matrix Effect,ME)=(A-B)/B×100%。表4为莲雾基质中四种杀菌剂在5～100 ng/mL浓度范围内的基质效应(正值表示基质增强效应，负值表示基质抑制效应)。结果表明，氟硅唑、戊唑醇和烯唑醇表现为基质抑制效应，抑霉唑表现为基质增强效应。除烯唑醇在较高浓度时基质效应小于10%外，四种杀菌剂的基质效应都大于10%，最大值为-32.8%，说明基质效应对定量结果的影响较大，计算时需要使用基质标准曲线进行校准。

表4 氟硅唑等四种杀菌剂在莲雾提取液中的基质效应

2.6 实际样品的测定

采用本实验建立的方法测定了采集于海口市南北水果批发市场的15份莲雾样品，均未检出氟硅唑、戊唑醇、抑霉唑和烯唑醇四种杀菌剂。

3 结论

本研究建立了一种基于QuEChERS前处理方法，结合UPLC-MS/MS法快速检测莲雾中氟硅唑、戊唑醇、抑霉唑和烯唑醇等四种杀菌剂。实验优化了UPLC与MS的采集参数，确定了吸附剂的种类及用量，并考察了四种杀菌剂的基质效应。方法学考察及实际样品测定证明该方法具有简便、快速、准确度高、成本较固相萃取低廉等优点，可用于莲雾中氟硅唑等四种杀菌剂的检测，具备一定的推广价值。