表面增强拉曼光谱法测定市售奶粉中的硫氰酸根

陈小曼， 张凯歌， 胡玉玲， 肖小华， 李攻科*

(中山大学化学与化学工程学院，广东广州 510257)

SCN-是一种典型的类卤素，具有很强的配位能力和卤素性质。将SCN-与过氧化物加入奶粉中，可阻断细菌代谢，起到良好的抑菌、保鲜效果。虽然SCN-的毒性不及CN-，但摄入过量会抑制人体内的碘转移，严重影响甲状腺功能[1,2]。自2008年12月12日起，我国政府明令禁止将硫氰酸盐作为牛奶或其它食品的添加剂；2010年开始，SCN-成为我国食品安全抽检的新增项目。目前，有关SCN-的检测方法主要有离子色谱(Ion Chromatography,IC)法[3,4]、高效液相色谱法[5,6]、气相色谱法[7 - 9]、毛细管电泳法[10,11]等。其中，IC法是硫氰酸盐检测的推荐标准方法[15]。但该方法的样品前处理步骤繁琐、耗时长，不利于现场快速检测。

表面增强拉曼光谱(Surface-enhanced Raman Spectroscopy,SERS)是一种新型光谱分析手段，具有所需样品量少、操作简单、快速、高效、可进行无损分析等特点，可用于现场实时快速检测。目前已在生物[12 - 14]、食品[15 - 18]、环境[19 - 21]等领域得到广泛应用。Yang等[22]采用SERS法测定奶粉中SCN-时，以银纳米粒子作为增强试剂，SCN-的线性范围为2.0～191.0 mg/L。但该方法的检测灵敏度较差，难以检测实际奶粉样品中的SCN-。本文采用商品化SERS增强试剂CP-1，建立了奶粉中SCN-的SERS快速分析方法，并与IC法结果进行对比分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Delta Nu Inspector便携式拉曼光谱仪(美国，Delta Nu)；DX-320离子色谱仪(美国，戴安公司)；IonPac AS19强亲水性阴离子分析柱(250×4.0 mm)；IonPac AG16保护柱(50×4.0 mm)；TG16-WS离心机(湘仪离心机仪器有限公司)；C18净化柱(广州绿百草生物科技有限公司)。

KSCN标准品、三氯乙酸、KOH、正己烷、正庚烷、石油醚和环己烷，均购自广州化学试剂厂；硅胶和中性氧化铝购自上海五四化学试剂有限公司；弗罗里硅土和活性碳购自天津市福晨化学试剂厂；C18硅胶购自J.T.Baler公司；色谱纯乙腈购自北京Dikma公司；SERS增强试剂CP-1购自厦门市普识纳米科技有限公司。实验用水为纯净水。

1.2 SERS实验方法

1.2.1标准溶液的配制将KSCN标准品于80 ℃烘箱内烘干2 h后，准确称取0.1673 g于100 mL容量瓶中，用水定容，即得1 000 mg/L SCN-标准储备液。移取1 mL标准储备液于100 mL容量瓶中，以150 g/L的三氯乙酸水溶液定容，即得10.0 mg/L SCN-标准中间溶液。移取不同量的标准中间液，并用150 g/L的三氯乙酸水溶液稀释成0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mg/L的SCN-系列标准工作液。

1.2.2奶粉样品前处理称取奶粉样品0.10 g和C18硅胶0.05 g于15 mL离心管中，加入10 mL三氯乙酸水溶液(150 g/L)，充分摇匀，300 W下超声波辅助萃取5 min，9 000 r/min下离心5 min后静置，待测。

1.2.3SERS检测拉曼光谱条件：测试模式为Soft Ware，积分时间为15 s，测定次数为5次，每次测试扣除暗电流1 s，激光功率为High，结果为Average，分辨率为Low。移取300 μL SERS增强试剂CP-1于拉曼管中，加入100 μL待测液，混匀后进行SERS检测。根据SCN-的特征峰定性，根据峰面积定量。

2 结果与讨论

2.1 SCN-定量峰的选择

通过空白溶液和不同浓度SCN-溶液的SERS测试发现，SCN-的SERS谱峰较简单，SCN-溶液在约2 110 cm-1受干扰少且有较明显拉曼响应。随着SCN-的浓度增大，其特征谱峰的响应强度逐渐增大。这可能是SCN-吸附在金的表面，引起了C≡N键的伸缩振动响应[23]，因此选择2 110 cm-1为SCN-的特征峰。

2.2 SERS法样品前处理条件的优化

2.2.1萃取溶剂的选择分别考察了纯净水和20、100、150 g/L三氯乙酸水溶液作为萃取溶剂时的测定效果。体系中三氯乙酸主要有三个作用：萃取奶粉中的SCN-；沉淀奶粉中的蛋白质以利于SERS检测；使SERS增强试剂团聚以增强其SERS信号。结果表明，萃取溶剂对SCN-的测定有较大影响，150 g/L的三氯乙酸水溶液效果最好。因此后续实验选择150 g/L的三氯乙酸水溶液作为萃取溶剂。

2.2.2超声波辅助萃取时间优化优化了超声波辅助萃取时间(0、1、3、5、7 min)对奶粉中SCN-萃取效果的影响。结果表明，当超声萃取5 min后，SCN-的特征谱峰面积最大，萃取效果最好。因此选择5 min作为超声波辅助萃取时间。

2.2.3离心时间的优化离心时间对SCN-的SERS信号强度也有较大影响。样品进行超声波辅助萃取后分别在9 000 r/min条件下离心0、1、3、5、10 min进行SERS检测。结果表明，当离心时间小于3 min时，SCN-的特征峰不明显；当离心时间超过5 min时，2 110 cm-1附近SCN-的特征峰强度基本不变。因此选择离心时间为5 min。

2.2.4降低基质干扰的方法探究奶粉中存在的脂肪、蛋白质等对SERS检测有较大影响。而大部分脂肪极性较小，蛋白质中氨基酸的R基为非极性或疏水性时，也表现出弱极性或者非极性。根据相似相溶原理，选择极性小的溶剂对SCN-萃取液进行净化，有望除去干扰物、降低奶粉基质干扰，提高SERS方法的灵敏度。本文研究了正己烷、环己烷、正庚烷和石油醚[24]对SCN-萃取液的净化效果(图1)。结果发现，不经过有机溶剂净化时，所得样品中SCN-的SERS峰面积是同浓度标准溶液SERS峰面积的0.42倍，表明样品基质干扰较严重。当使用有机溶剂进行净化后，样品中SCN-的峰面积均有所增加，其中石油醚效果最好，能达到同浓度标准溶液的0.58倍。表明采用有机溶剂净化处理能减少部分基质干扰，但其效果并不理想。

另一方面，本文研究了弗罗里硅土、活性碳、硅胶、中性氧化铝和C18硅胶等吸附材料[25]对奶粉中杂质的吸附及降低基质干扰的效果(图2)。经吸附材料处理后，所有样品中SCN-的SERS峰面积均有一定程度的增加。其中，经过C18硅胶吸附杂质后，样品中SCN-的峰面积达到同浓度标准溶液峰面积的0.76倍，效果较好，说明添加C18硅胶能有效降低样品的基质干扰。故后续实验中选择C18硅胶降低样品的基质干扰。

图1 有机溶剂降低基质干扰的效果Fig.1 The effect of organic solvents to reduce the matrix interferences Dotted line represents the peak area of standard solution.

图2 吸附材料降低基质干扰效果Fig.2 The effect of adsorbing materials to reduce the matrix interference Dotted line represents the peak area of standard solution.

2.3 SERS检测条件的优化

2.3.1SERS增强试剂与待测液体积比SERS增强试剂与待测液体积比对SCN-的SERS检测至关重要。本文考察了SERS增强试剂与待测液体积比分别为1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1 时SCN-的SERS谱峰强度变化。结果表明，随着增强试剂与待测液体积比的增加，2 110 cm-1处SERS峰强度呈现逐渐增大的趋势；当体积比为3∶1时，峰强度最大。最终选择增强试剂与待测液体积比为3∶1。

2.3.2积分时间的优化SERS分析中，积分时间对SCN-的SERS检测也有较大的影响。本实验中，随积分时间的增加，SCN-的特征峰信号呈逐渐增强的趋势，但积分时间大于15 s后信号将溢出。因此，选择积分时间为15 s。

2.4 奶粉中SCN-的分析

2.4.1SERS法分析SCN-配制0.10～0.60 mg/L的SCN-系列标准溶液，在优化实验条件下，以2 110 cm-1处谱峰为定量峰进行SERS分析。结果表明，SERS峰面积和SCN-浓度在0.10～0.60 mg/L范围内呈现良好的线性关系，工作曲线方程为：Y=6.104×104X+2.322×104，相关系数r2=0.9933，检出限为0.05 mg/L。

2.4.3SERS法与IC法对比分析随机抽取35种市售不同奶粉(其中婴幼儿奶粉15种、中老年奶粉4种、孕妇奶粉8种和儿童奶粉8种)进行SCN-的SERS分析。结果表明，35种奶粉中，有24种奶粉中SCN-含量高于10.0 mg/kg，7种奶粉的SCN-含量高于25.0 mg/kg。使用IC法对同批奶粉进行对比分析，结果表明，同一样品中SCN-的SERS测定值与IC测定值的比值在0.70～1.06之间，两种方法的分析结果符合度和重现性良好，方法之间无显著性差异，各类奶粉的典型测试结果见表1。图3和图4分别为奶粉中SCN-分析的SERS谱图和IC谱图。随机选取4种不同奶粉添加SCN-进行回收率实验验证SERS方法的可行性。结果见表2，SCN-的回收率在70.5%～109%之间，RSD小于9.8%。

表1 不同奶粉样品中SCN-含量的方法对比结果(n=3)

表2 实际样品的SERS测定结果及加标回收率(n=3)

图3 奶粉中SCN-测定的SERS谱图Fig.3 SERS spectra of SCN- in milk powder

图4 奶粉中SCN-测定的IC图Fig.4 Chromatogram of SCN- in milk powder

3 结论

本文建立了奶粉中SCN-的表面增强拉曼快速检测法，分析了市售35种奶粉中的SCN-含量，并与离子色谱法进行比对分析。结果表明，奶粉中SCN-的SERS方法与IC方法分析结果符合度和重现性良好，两种方法之间没有显著差异。相对而言，SERS法可大大降低实验耗时、简化实验过程并降低实验成本。该方法具有实现奶粉中硫氰酸根现场快速检测的应用潜力。