磁固相萃取结合高效液相色谱测定血清中的抗抑郁药

2016-10-16程青云袁必锋冯钰锜

分析科学学报 2016年3期

应娟，程青云，袁必锋*，冯钰锜

(生物医学分析化学教育部重点实验室，武汉大学化学与分子科学学院，湖北武汉 430072)

图1 三种抗抑郁药的结构式Fig.1 Chemical structures of the antidepressants

抑郁症是一种常见的、威胁人们生命安全的慢性疾病，而大约有15%的抑郁症患者自杀身亡[1]。西酞普兰(Citalopram)、氟西汀(Fluoxetine)、舍曲林(Sertraline)属于抗抑郁药中选择性5羟色胺再吸收抑制剂(SSRIs)类药物，是第二代抗抑郁药[2]，结构式见图1。相对于第一代单胺氧化酶抑制剂类(MAOIs)以及三环类(TCAs)抗抑郁药，SSRIs有较小的抗胆碱性和副作用，因此广泛用于临床上抑郁症的治疗[3]。为了能够准确、合理用药以提高药效，降低副作用，实现个体化治疗，需对患者进行血药浓度的监测，以利于临床对症治疗[4]。因此，对抗抑郁药进行快速提取及分析检测十分重要。

在抗抑郁药的检测过程中，为排除基质的干扰和提高检测方法的灵敏度，固相萃取(SPE)[5]、液液萃取(LLE)[6]、固相微萃取(SPME)[7]等方法都被应用于血清样品的预处理中。固相微萃取可避免普通固相萃取技术中的繁琐过柱操作、吸附柱易堵塞、重现性差等问题，且具有操作简单、萃取时间短、有机试剂用量少等优点，受到众多关注[8 - 10]。其中磁固相萃取(MSPE)[11 - 14]的磁性萃取介质可直接分散于样品溶液中，尤其适用于含固体悬浮的样品以及生物样品。

西酞普兰、氟西汀和舍曲林同为胺类化合物，分子中都含有两个苯环和氨基基团，具有一定的疏水性和离子性，疏水功能基团C8及离子基团-SO3H改性的Fe3O4/SiO2有望对其进行富集。本研究将MSPE引入血清样品的预处理中，结合高效液相色谱-紫外检测(HPLC-UV)测定血液中这3种抗抑郁药，方法的选择性高、重现性好，可以有效地对血清样品中的抗抑郁药物进行定量分析。

1 实验部分

1.1 试剂与材料

三种目标物储备液浓度为1 mg/mL，以甲醇逐级稀释目标物储备液，配制不同浓度标准溶液(15、20、50、100、200、400、800和1 000 ng/mL)，于4 ℃避光保存。

盐酸氟西汀(纯度≥98%)、盐酸舍曲林(纯度≥99.90%)(百灵威化学技术公司)，草酸西酞普兰(纯度≥98%)(美国Aladdin公司)；乙腈(ACN)、乙醇、甲苯、三乙胺、乙二醇、乙二胺、无水NaAc、NaH2PO4、H2SO4、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、正硅酸四乙酯、FeCl3·6H2O、NH3·H2O、30%H2O2、NaOH(分析纯，上海国药基团试剂有限公司)；正辛基三乙氧基硅烷(OTS，纯度≥97%，湖北武大有机硅新材料股份有限公司)、3-巯丙基三乙氧基硅烷(MPS，纯度≥95%，湖北德邦化工新材料有限公司)；超纯水(Millipore公司，美国)。

空白血清样品来自无药史的健康志愿者(武汉大学校医院)血样，置于-80 ℃保存。

1.2 磁性材料(Fe3O4/SiO2/C8-SO3H)的制备

包硅磁性材料(Fe3O4/SiO2)的制备参考文献方法[11]。辛基磺酸基共同改性的磁性材料(Fe3O4/SiO2/C8-SO3H)的制备参考文献方法[15]并进行改进。取Fe3O4/SiO22.07 g，NaOH 0.17 g，CTAB 0.53 g 及H2O 31.4 mL，置于聚四氟乙烯反应釜中，于温度130 ℃反应24 h，冷却后经水和乙醇交替清洗数次，60 ℃真空干燥后，放于马弗炉中550 ℃煅烧7 h。取煅烧后的磁性颗粒1.97 g，无水甲苯140 mL，OTS 1.00 g，MPS 0.87 g，三乙胺30 μL，置于聚四氟乙烯反应釜中。于130 ℃反应20 h，清洗后放于真空干燥箱中干燥。将干燥后的磁颗粒置于250 mL烧瓶中，加入30%H2O2191 mL，甲醇57 mL，3滴浓H2SO4，机械搅拌，30 ℃反应16 h，产物用水与甲醇清洗，真空干燥，待用。

1.3 血清样品制备

移取300 μL血清样品，加入西酞普兰、氟西汀和舍曲林标准溶液，然后用50 mmol/L NaH2PO4(pH=6.0)稀释至3 mL。准确称取35 mg磁性材料于15 mL安普瓶中，分别用2 mL乙醇、2 mL 50 mmol/L NaH2PO4溶液(pH=6.0)活化，然后加入上述3 mL加标溶液，涡旋萃取1 min后，在外磁场作用下分离弃去上清液。再用2 mL 水∶甲醇∶甲酸(95∶5∶0.5，V/V/V)混合溶液清洗3次，再用3 mL 5 mmol/L甲醇-氨水(90∶10，V/V)涡旋解吸1 min，解吸液在氮气下吹干，用100 μL流动相重新溶解，取20 μL进行液相色谱-紫外检测。

1.4 仪器与色谱条件

LC-20A高效液相色谱(日本，岛津公司)，配二元LC-20AD泵，DGU-20A3脱气机，SIL20A自动进样器，CTO-20A柱温箱，SPD-20A紫外检测器；WELTECH C18色谱柱(150×4.6 mm i.d.,5 μm)，柱温35 ℃；流动相为乙腈-10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH=3.5)(40∶60，V/V)，流速1 mL/min，进样体积20 μL；检测波长230 nm。

2 结果与讨论

2.1 萃取条件的优化

2.1.1基质的pH值抗抑郁药为碱性胺类化合物，溶液pH值会影响分析物的存在状态，并进一步影响萃取效果。配制pH值分别为3～9的缓冲溶液，考察pH值对萃取效果的影响。由图2A可知，在pH为3～6的条件下，萃取效果相差不大。pH>6时，萃取效率逐渐下降。这是由于西酞普兰、氟西汀和舍曲林的pKa分别为9.59、10.05和9.47，吸附材料与目标物之间既有疏水作用，又有离子交换作用，当pH>6时，目标物逐渐以分子形式存在，离子交换作用逐渐减弱，萃取效率下降。本研究选择基质pH值为6。

2.1.2缓冲溶液的浓度配制了不同浓度的NaH2PO4缓冲液(5、10、20、50、100和200 mmol/L)，考察缓冲液浓度的影响，结果见图2B。盐浓度的增加降低了抗抑郁药与萃取材料的离子交换作用，从而使萃取效率增加。实验选取缓冲液的浓度为50 mmol/L。

2.1.3材料用量和解吸体积考察了萃取材料用量为15、25、35、45和55 mg时的萃取效果，如图2C。由图可见，萃取材料适宜用量选取35 mg。考察了解吸体积为1、2、3、4和5 mL时的萃取效果，如图2D。当萃取体积增加时，萃取效率稍有增加，为保证实验稳定性，同时减少氮气吹干的时间，本研究中解吸体积选取3 mL。

2.1.4萃取时间和解吸时间考察了萃取时间分别为1、2、3、4和5 min的萃取效果，如图2E。结果表明，萃取时间对萃取效果无显著影响，在1 min时已达平衡。本研究选取1 min作为萃取时间。考察了解吸时间为1、2、3、4和5 min时的萃取效果，见图2F。结果表明，解吸时间对萃取效果同样无显著影响。本研究选取1 min作为解吸时间。

图2 MSPE萃取条件的优化：(A)磷酸缓冲盐的pH；(B)磷酸缓冲盐浓度；(C)材料的用量；(D)解吸液的体积；(E)萃取时间；(F)解吸时间Fig.2 Optimization of MSPE conditions:(A) matrix pH;(B) salt concentration;(C) amount of sorbent;(D) desorption volume;(E) extraction time;(F) desorption time

2.2 方法学考察

2.2.1线性方程及检出限以空白血清为基质，分别配制15、20、50、100、200、400、800和1 000 ng/mL系列混合标准溶液，在最优条件下测定，以分析物峰面积对质量浓度绘制标准曲线，在15～1 000 ng/mL浓度范围内，三种抗抑郁药均呈良好的线性关系，实验结果见表1。

表1 三种抗抑郁药的线性方程、相关系数、检出限(LOD)和定量限(LOQ)

2.2.2回收率和精密度为了考察方法的重现性，添加低、中、高3个浓度水平的待测物至上样液中进行萃取，对1 d内独立配制的样品进行5次测定，计算日内相对标准偏差(RSD)，以连续3 d独立配制的样品进行测定，计算日间相对标准偏差(RSD)，结果如表2所示。结果表明，本方法具有较好的重现性。

表2 三中抗抑郁药在三种浓度水平下的加标回收率及日内、日间精密度

图3 加标 (a)和空白(b)血清样品色谱图Fig.3 Chromatograms of serum sample spiked with three antidepressants at 400 ng/mL (a) and blank serum sample (b)1.Cltalopram;2.Sertraline;3.Fluoxetine.

a:Values are mean ±SD of five experiments.