基于上转换荧光共振能量转移的ClO-纳米探针

李 亚， 李 贞， 梁 涛， 肖仲文， 刘志洪

(生物医学分析化学教育部重点实验室，武汉大学化学与分子科学学院，湖北武汉 430072)

荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)作为一种均相检测技术具有操作简单、灵敏度高等优点，已广泛运用于免疫分析、核酸杂交等领域。传统的单光子激发所构建的FRET技术，常采用下转换荧光材料为能量供体，紫外光或可见光为激发光源，易产生生物样品本底发光和能量供受体同时被激发等问题，大大限制了FRET技术的应用[1]。上转换荧光材料(Upconversion Nanoparticles，UCNPs)是一类稀土离子掺杂、反Stokes荧光的无机纳米材料。因其能连续吸收两个或多个低能量的近红外光子到达激发态，发射出紫外、可见或近红外光[2]，可有效避免单光子激发FRET技术中的问题，因此UCNPs是一类极具发展前景的FRET能量供体。

目前，基于上转换荧光共振能量转移(UC-FRET)已成功应用于复杂生物基质中的蛋白、酶、核酸等目标物的检测[3,4]。为了保证UCNPs的荧光强度，其尺寸通常在30～50 nm，然而FRET供受体距离在10 nm 以下才能有效发生，只有在UCNPs表面或距离表面很近的发光中心才易发生FRET，因此FRET效率受限。“核-内壳-外壳”夹心结构的SWUCNPs(NaYF4@NaYF4∶Yb,Tm@NaYF4)，其稀土发光离子定位于内壳层中且紧邻外壳，壳层厚度均可控在几个纳米[5,6]，相较于传统均相UCNPs，夹心结构SWUCNPs极大地缩短发光中心与能量受体之间的距离，有利于FRET发生，猝灭效率高，检测灵敏度高。同时，SWUCNPs外壳层是惰性的NaFY4基质，可有效地阻止溶剂分子猝灭内壳中稀土离子的发光，提高UCNPs的荧光强度[7]。

ClO-作为重要的活性氧类分子之一，具有强氧化性。在哺乳动物免疫系统中，适量的ClO-可消除细菌引起的炎症，然而过量的ClO-往往与癌症、心血管、关节炎等疾病有关[8]。目前已报道的基于氨基硫脲[9]、对甲氧基苯酚[10]、二氢荧光黄[11]等有机染料构建的ClO-荧光探针，因检测时需要紫外光或可见光激发，生物样本背景荧光和散射光干扰严重，导致灵敏度不高。为克服上述缺陷，本文设计了基于UC-FRET并以夹心结构SWUCNPs为能量供体，FITC为能量受体的新型ClO-纳米探针。该探针用于检测水溶液中ClO-含量，猝灭效率高达95%，线性范围为0.02～3.4 mmol/L，检出限为0.008 mmol/L。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

RF-5301PC型荧光分光光度计(日本，岛津公司)；UV-2550型紫外-可见分光光度计(日本，岛津公司)；H-7000FA型透射电镜(日本，Hitachi公司)；980 nm半导体近红外激光(北京海特光电有限责任公司)；D8型X射线衍射仪(德国，Bucker公司)；Legend-Micro-17R型高速冷冻离心机(美国，Thermo Scientific公司)。

Y2O3、Yb2O3、Tm2O3、油酸(OA)、5%～8%NaClO水溶液，均购于上海国药集团化学试剂有限公司；十八烯(ODE)、对硝基苯甲醛、哌啶、吡啶、3-(N-吗啡啉)丙磺酸(MOPS)，均购于上海晶纯生化科技股份有限公司(阿拉丁)；还原铁粉购于天津市科密欧化学试剂有限公司；异硫氰酸荧光素(FITC)购于北京百灵威科技有限公司；4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)购于美国Sigma-Aldrich公司；所有试剂均为分析纯，实验所用水为超纯水。

1.2 油酸修饰夹心结构上转换荧光材料(OA-SWUCNPs)的合成

OA-SWUCNPs按照文献报道的晶种生长法[12,13]合成。称取840 mg NaF固体于三口烧瓶中，依次加入0.75 mmol油酸钇，10 mL 油酸和10 mL 十八烯。抽真空，氩气保护，升温至120 ℃反应1 h，再升温至320 ℃反应2 h。从烧瓶中取出4 mL反应液，缓慢注入0.4 mmol稀土油酸盐(溶于8 mL OA∶ODE=1∶1混合溶剂中)，反应30 min。接着取出6 mL反应液，再缓慢注入1.6 mmol油酸钇(溶于8 mL OA∶ODE=1∶1混合溶剂中)，反应30 min。自然冷却至室温，反应液加入等体积无水乙醇，离心收集沉淀。沉淀用混合溶剂(乙醇∶己烷=4∶1，体积比)离心洗涤6次，最后超声分散在8 mL无水乙醇中，置于4 ℃冰箱中，备用。

1.3 表面裸露的夹心结构上转换荧光材料(Bared SWUCNPs)的制备

Bared SWUCNPs的合成步骤参照文献方法[14,15]。取4 mL OA-SWUCNPs乙醇分散液于50 mL圆底烧瓶中，加入30 mL pH=1的乙醇溶液(用浓HCl调节pH)超声2 h，离心分离，收集沉淀。所得沉淀用pH=4的乙醇溶液离心洗涤1次，无水乙醇洗涤2次，水洗涤3次，最后超声分散在4 mL水中，置于4 ℃冰箱中，备用。

1.4 4-氨基苯基丙烯酸配体的合成

4-氨基苯基丙烯酸的合成路线如图1所示。称取对硝基苯甲醛2.0 g(13 mmol)和丙二酸1.3 g(12.5 mmol)，加入0.3 mL哌啶和18 mL吡啶，加热冷凝回流反应4 h。反应结束后，将反应液滴加到大量水中，用浓HCl调混合溶液至酸性，抽滤后用水洗涤数次，乙醇洗涤数次，得到固体产物4-硝基苯基丙烯酸，产率96%。取10 mL水和10 mL乙醇注入50 mL单口烧瓶中，搅拌均匀，加入4-硝基苯基丙烯酸0.5 g(2.591 mmol)，还原铁粉0.2902 g(5.181 mmol)和NH4Cl 0.2772 g(5.181 mmol)，在80 ℃空气浴下搅拌溶解，氮气保护下反应1 h。反应完成后向烧瓶中加入适量水，然后加入乙酸乙酯萃取分离，收集上层有机相，旋转蒸发除去大部分溶剂。将所得粗品用硅胶柱层析提取(淋洗剂：乙酸乙酯∶石油醚=1∶2，加1%冰乙酸)，旋转蒸发除去溶剂得到黄色固体，即为产物4-氨基苯基丙烯酸，产率35%。1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)：11.96(s，1H)，7.42(d，1H)，7.35(d，2H)，6.56(d，2H)，6.13(d，1H)，5.74(s，2H)。

图1 4-氨基苯基丙烯酸的合成路线Fig.1 The synthesis schematic diagram of 4-aminophenylacrylic acid

1.5 ClO-探针的制备

1.2 mg bared SWUCNPs分散于1 mL 30 mmol/L的MOPS缓冲溶液(pH=7.2)中，加入10 μL 10 mg/mL 4-氨基苯基丙烯酸(DMSO溶液)，置于摇床中避光反应12 h。反应结束后，再向离心管中加入60 μL 10 mmol/L的FITC，继续避光反应6 h。离心收集沉淀，用水离心洗涤沉淀3次，最后将沉淀超声分散在1 mL水中。将得到浓度为1.2 mg/mL的探针溶液，避光置于4 ℃冰箱中，备用。

1.6 基于UC-FRET的ClO-检测原理

夹心结构上转换能量供体SWUCNPs包含三层：核、内壳和外壳。核是没有掺杂发光离子的NaYF4纳米粒子，内壳层是掺杂了稀土发光离子Tm3+的荧光层。内壳层中发光离子Tm3+随机分布，处于内壳层表面的Tm3+其上转换荧光会被溶剂分子猝灭，降低UCNPs的荧光强度。为了避免溶剂分子对Tm3+荧光的猝灭，内壳层表面又覆盖了一层惰性的NaYF4基质外壳。外壳厚度可控制在几个纳米，有效地缩短供体离子与能量受体之间的距离，有利于提高FRET过程的能量转移效率。与此同时，SWUCNPs表面配体OA可通过酸处理的方法去除得到bared SWUCNPs，这样有利于在其表面修饰上新的功能基团。如图2所示，当向bared SWUCNPs中加入过量4-氨基苯基丙烯酸配体，该配体分子中游离的羧基与暴露在SWUCNPs表面的稀土离子通过配位作用连接到SWUCNPs。而另一端游离的氨基与FITC通过共价偶联结合，除去多余的FITC即得到ClO-探针。该探针能量供体和能量受体之间距离小，UC-FRET效率高。当探针加入到ClO-溶液中，4-氨基苯基丙烯酸中的碳碳双键被ClO-氧化切断，SWUCNPs和FITC之间距离增大，FRET作用消失，SWUCNPs的荧光得到恢复，并且荧光的恢复程度与ClO-的浓度在一定范围内成正比例关系，从而可实现对ClO-的定量检测。

图2 基于UC-FRET纳米探针检测ClO-的示意图Fig.2 Schematic illustration of the nanoprobe for ClO- based on UC-FRET from SWUCNPs to FITC

2 结果与讨论

2.1 SWUCNPs的表征

SWUCNPs的合成采用层层自组装晶种生长法，油酸作为表面配体。从图3透射电镜(TEM)图中，可以十分清晰地看出核、内壳和外壳生长的变化过程。NaYF4核(图3A)，NaYF4@NaYF4∶Yb,Tm核-内壳结构(图3B)，NaYF4@NaYF4∶Yb,Tm@NaYF4夹心结构(图3C)，随着壳层不断增加，纳米粒子的粒径逐渐增大，得到尺寸均一的球形纳米颗粒。图3D为bared SWUCNPs的TEM图，图中所示 bared SWUCNPs也是大小均一的球形纳米颗粒。说明酸处理过程不会破坏SWUCNPs的尺寸及微观形貌。

图3 (A) NaYF4核结构；(B) NaYF4@NaYF4∶Yb,Tm核-壳结构；(C) NaYF4@NaYF4∶Yb,Tm@NaYF4夹心结构；(D) bared NaYF4@NaYF4∶Yb,Tm@NaYF4夹心结构透射电镜(TEM)图Fig.3 TEM images and size distribution of NaYF4core (A);Core-shell structure NaYF4@NaYF4∶Yb,Tm (B);NaYF4@NaYF4∶Yb,Tm@NaYF4sandwich structure (C);Bared NaYF4@NaYF4∶Yb,Tm@NaYF4 (D)

由图4(A)X射线粉末衍射(XRD)图结果可以看出，该方法合成得到的NaYF4核，NaYF4@NaYF4∶Yb,Tm 核-内壳结构，NaYF4@NaYF4∶Yb,Tm@NaYF4夹心结构都为纯六方相。图4(B)中bared SWUCNPs与OA-SWUCNPs的XRD谱图一致，晶体结构为六方相，说明酸处理去除SWUCNPs表面油酸配体时不会改变其晶体结构。

图4 所得到纳米晶体的X射线粉末衍射图谱Fig.4 XRD patterns of the obtained nanocrystals

2.2 ClO-探针的表征

选用4-氨基苯基丙烯酸作为ClO-的识别分子，本文通过酸处理去除SWUCNPs油酸配体，4-氨基苯基丙烯酸一端游离的羧基与暴露在bared SWUCNPs表面的稀土离子通过配位作用结合，另一端游离的氨基与能量受体FITC共价偶联得到ClO-探针，这种探针的构建方式更进一步缩短了能量供受体之间的距离，极大地提高了FRET能量转移效率。对该探针进行傅里叶红外(FI-IR)光谱表征，如图5(A)所示SWUCNPs的FT-IR谱图中，2 964 cm-1和2 854 cm-1是亚甲基中的C-H伸缩振动峰，1 564 cm-1是烯烃中C=C的伸缩振动峰，752 cm-1是烯烃中=C-H的伸缩振动峰，这些都是OA分子的特征峰。而在 bared SWUCNPs的FT-IR谱图中这些特征峰均几乎消失，这一变化说明酸处理方法成功去除了SWUCNPs表面的OA配体。由紫外-可见吸收光谱(图5(B))可以看出，bared SWUCNPs偶联通过4-氨基苯基丙烯酸与FITC偶联之后在480 nm处有明显的FITC特征吸收，这表明FITC成功偶联到SWUCNPs上。

图5 (A) OA-SWUCNPs和bared SWUCNPs的傅里叶红外光谱；(B) bare -SWUCNPs(a),bare -SWUCNPs与有机配体的偶联物(b)，探针分子(c)和FITC(d)的紫外-可见吸收光谱Fig.5 (A) FT-IR spectra of the oleate -capped SWUCNPs and bared SWUCNPs;(B) The UV-Vis absorption spectra of bare -SWUCNPs before(a) and after(b) attachment of organic ligands,probe(c) and FITC(d)

图6 (A)相同浓度SWUCNPs和探针的上转换荧光光谱；(B) 探针荧光回升程度随时间变化图Fig.6 (A) Upconversion fluorescence emission spectra of SWUCNPs and probe;(B) The plot of fluorescence response of probe after adding ClO-(2.4 mmol/L) as a function of time

2.3 ClO-对探针的定量检测

图6(A)是相同条件下测得的bared SWUCNPs和探针的上转换荧光强度，说明该探针的FRET效率很高，猝灭效率可达95%。当将一定量NaClO溶液加入到探针溶液中，因有机配体被ClO-氧化，碳碳双键断裂，导致供受体之间距离增大，FRET减弱，bared SWUCNPs荧光恢复。当在0.06 mg/mL探针溶液中加入2.4 mmol/L ClO-后，供体荧光随着时间的延长而逐渐恢复，反应时间到达30 min时bared SWUCNPs荧光恢复到最大值，并到达平台，如图6(B)所示。为了获得稳定的检测信号，在此后的回升实验中，统一选定反应时间为30 min。

在反应体系中保持探针浓度(0.06 mg/mL)不变，ClO-浓度从0 mmol/L逐渐增加到3.4 mmol/L，如图7所示，供体在480 nm波长处相对荧光强度((F-F0)/F0(其中，F0代表没有ClO-存在时供体的荧光强度，F代表加入不同浓度ClO-后供体的荧光强度)不断增大，并且增大的程度与ClO-浓度在0.02～3.4 mmol/L范围内呈现良好的线性关系，线性相关系数R2为0.992，检出限为0.008 mmol/L。

图7 (A) 980 nm激光激发下不同浓度ClO-对探针荧光的回升光谱；(B) 980 nm激光激发下相对荧光强度与ClO-浓度的线性关系Fig.7 (A) Fluorescence emission spectra of probe excited with 980 nm light in the presence of varying amounts of ClO-;(B) The linear relationship of the fluorescence recovery and the concentration of ClO- under excitation at 980 nm The concentration of ClO- from a to m:0,0.02,0.04,0.08,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,2.0,2.6,3.0,3.4 mmol/L.

2.4 基于FRET的ClO-检测方法的选择性

图8 其他物质的干扰性考察Fig.8 Relative fluorescence intensity of the probe in the presence of different substances

为了考察本方法的选择性，在检测体系中加入H2O2、半胱氨酸(Cys)、Fe2+以及葡萄糖等干扰物质，25 ℃下孵育30 min，然后在相同条件下测定上转换荧光强度。结果如图8所示，在加入的干扰物浓度与ClO-相同的情况下，只有加入ClO-后供体荧光得到明显的恢复，而干扰物对探针的荧光没有明显影响，尤其是其他活性氧物质的影响与空白对照组接近，证实该探针对ClO-具有良好的选择性。

ClO-是漂白剂的有效成分，常用于饮用水消毒，饮用水中残留的ClO-含量一般为μmol/L水平。另外，ClO-作为一种重要的活性氧物质，参与众多生理过程，据文献报道处于发炎状态下生物体中白细胞每小时能够产生0.02～0.4 mmol/L的ClO-[16]。本文构建的ClO-纳米探针，检测范围在0.02～3.4 mmol/L，检出限为0.008 mmol/L，由此可以预见该探针能够应用于环境和生物体中ClO-含量的检测。

3 结论

夹心结构UCNPs与传统UCNPs相比，稀土荧光离子尽可能多的集中在纳米粒子表面或距离表面很近的范围内，缩短了能量供受体之间的距离，FRET效率显著提高，从而提高分析检测灵敏度。本文利用SWUCNPs构建了基于UC-FRET的ClO-纳米探针，其荧光猝灭效率达95%，并在ClO-浓度为0.02～3.4 mmol/L范围内呈现良好的线性关系，检出限为0.008 mmol/L。SWUCNPs为构建基于UC-FRET的检测探针提供了一种新的能量供体，可将其应用于其他目标物的分析检测。