蛋白质印迹模板的制备及在尿液蛋白测定中的应用

邢建华，薄 惠，张 强

(黄河科技学院医学院，河南郑州 450063)

分子印迹(Msolecular Imprinted,MI)技术是从高分子聚合物领域发展而来的一项分子特异性识别技术，利用模板分子在印迹聚合物上形成空穴，对印迹分子产生特异性识别，当印迹分子再次遇到模板分子时就能够对模板分子产生特异性吸附。目前，MI技术已经成功应用到药物分离分析[1]、牛奶中三聚氰胺的检测[2]、薰衣草精油中樟脑的提取[3]、瓜果蔬菜中残留农药的检测[4]等方面，但在DNA、蛋白质等生物大分子的测定方面研究较少。

经典的蛋白质测定方法主要有Lowry法[5]、Bradford法[6]及溴酚蓝法[7]等，这些方法存在灵敏度低或线性范围窄等缺点。近年来，建立了一些测定蛋白质的新方法，如分光光度法[8 - 10]、荧光光度法[11,12]、化学发光法[13,14]、分子探针荧光光谱法[15]及共振光散射法[16]等。人尿中的蛋白质含量测定是慢性肾炎、紫癜性肾炎、狼疮性肾炎、糖尿病肾病等典型的诊断标准之一。因此制备牛血清白蛋白分子印迹模板，进行吸附-解吸，去除人尿中的共存干扰物质，建立人尿中蛋白质的测定方法，具有十分重要的意义。本文以牛血清蛋白(BSA)为分子模板，甲基丙烯酸(MAA)为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDGMA)为交联剂，偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂制备的BSA分子印迹模板，具有较强的选择性，适用于复杂样品中蛋白质的分离分析。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

TU-1810型紫外可见分光光度计(北京普析通用)；HH-2恒温水浴锅(上海博讯)；AHS-1064烘箱(吴江华东标准烘箱公司)；pHS-3C型酸度计(上海仪田精密仪器有限公司)。

牛血清蛋白(BSA,美国Amresco公司,含量：98%)；甲基丙烯酸(MAA)、偶氮二异丁腈(AIBN)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDGMA)，均购于阿拉丁试剂有限公司，其余试剂均为分析纯。实验用水为蒸馏水。

1.2 实验方法

1.2.1BSA分子印迹模板的制备取0.5 g BSA于锥形瓶中，加入15 mL的乙酸∶甲醇(1∶1，V/V)混合溶液，超声5 min溶解后，加入0.338 mL MAA，超声10 min使其作用完全。最后加入6.93 mL EDGMA和20 mg AIBN混匀，通氮气15 min除氧，密封反应容器，恒温水浴锅内60 ℃反应24 h后取出，将生成的聚合物研磨后过筛。取100目和200目之间的聚合物，用0.1 mol/L的NaOH溶液连续洗脱约12 h，至洗脱液用紫外法检测不到BSA为止。洗脱后的聚合物用水和无水乙醇各洗三遍，晾干，备用。

1.2.2BSA印迹聚合物的吸附试验方法在100 mL 2 g/L的BSA水溶液中，加入1.00 g BSA印迹模板，吸附平衡后，于280 nm波长处测定吸光度，利用公式：Q=(c0-c1)V/m计算吸附容量。其中c0表示初始BSA的浓度(mg/mL),c1表示加入印迹分子之后的浓度(mg/mL)，V是BSA溶液的体积(mL)，m是加入印迹分子的质量(g)。

1.2.3人尿中蛋白质的测定方法取新鲜人尿20 mL,置干燥离心管中，以3 000 r/min离心20 min,精密吸取上清液5 mL，加入pH=5.2的缓冲溶液5 mL制成尿样待测液，加入BSA分子印迹模板300 mg,吸附完全后，用pH=5.6的磷酸盐缓冲溶液洗涤三次，每次10 mL，合并洗涤液于100 mL容量瓶中，定容。用紫外-可见分光光度计在280 nm波长处测定吸光度，代入工作曲线，计算蛋白质含量。

2 结果与讨论

2.1 功能单体的选择

分子印迹技术中常用的功能单体有丙烯酰胺、甲基丙稀酸、4-乙烯基吡啶等。实验分别以该三种功能单体制备了印迹模板，测定了三种模板对蛋白质的吸附容量，结果分别为：12.8 mg/g、67.4 mg/g和34.7 mg/g。由结果可知，甲基丙烯酸作为功能单体制备的分子印迹模板吸附容量最大，因此选择甲基丙烯酸作为蛋白质分子印迹模板制备过程中的功能单体。

2.2 吸附时间的选择

采用1.2.2方法，吸附一定时间后，测定吸光度值，结果示于图1。由图1可知，吸光度在120 min后变化较小，说明120 min时吸附到达平衡，因此，选择吸附时间120 min。

2.3 pH值的影响

配制不同pH值的磷酸盐缓冲溶液作为配制蛋白质溶液的溶剂，考察不同pH值下蛋白质印迹模板对蛋白质的吸附作用。采用1.2.2方法测定了不同pH值下吸附后蛋白质溶液的吸光度，结果示于图2。由图2可知，pH=5.6时吸光度值最大，表明此时吸附量最小；在pH值5.2时吸光度最小，表明此时吸附量最大。因此，pH=5.2磷酸盐缓冲溶液适合作为吸附溶液，pH=5.6的缓冲溶液适合作为洗脱剂。

2.4 吸附温度的选择

采用1.2.2方法，考察了不同温度下的吸附量，结果显示，10～30 ℃吸附容量无明显变化，高于30 ℃吸附容量下降，可能是温度升高蛋白质结构发生了变化，所以测定在室温下进行即可。

2.5 吸附容量的考察

配制不同浓度的蛋白质溶液，采用1.2.2方法测定蛋白质分子模板对不同浓度蛋白质溶液的吸附量，结果如图3所示。由图3可知，随着蛋白质溶液的浓度增大，吸附容量增大，最大吸附容量为72 mg/g。

2.6 工作曲线与检测限

用pH=5.6的磷酸盐缓冲溶液作为溶剂，配制一系列不同浓度的蛋白质溶液。测定不同浓度蛋白质溶液在280 nm波长处的吸光度A，以吸光度A对浓度c作图，结果表明蛋白质浓度在0.2022～2.022 mg/mL之间与吸光度呈现良好的线性关系，线性方程为：A=0.0111+0.587c相关系数为0.9997。检测限为0.124 mg/mL。

2.7 干扰试验

配制2 g/L的人尿中可能存在的共存物质溶液代替蛋白质溶液，采用1.2.2方法进行试验，其吸附容量示于表1。由表1可知，除半胱氨酸外，蛋白质分子印迹模板对其它共存物质无明显吸附，虽然半胱氨酸的吸附容量较大，但半胱氨酸在280 nm处无明显的吸收，所以对测定结果的准确度无影响。

表1 选择性试验

2.8 样品的测定与回收率

按1.2.3方法取样测定，并用考马斯亮蓝法进行对照，结果见表2。采用标准加入法进行回收率试验，结果见表3。由表2、表3可知，本文所建立的方法具有较好的准确度和精密度。

表2 人尿中蛋白质测定结果(n=5)

表3 回收率试验(n=5)

3 结论

合成了蛋白质分子印迹模板，并用它吸附人尿中的蛋白质，洗脱后进行测定。结果表明，该方法成功地除去共存的干扰物质，具有测定专属性强、灵敏度高、准确度较高等特点。该方法用于人尿中蛋白质的测定，结果满意。