核壳式氯霉素分子印迹聚合物碳纳米管复合材料的制备及应用

王小玉,孙复钱,曾国屏,刘昕昕,喻继文

(江西省科学院应用化学研究所，江西南昌 360102)

氯霉素类抗生素(Chloramphenicols，CAPs)是一种在委内瑞拉链霉菌(Streptomyces Venezuela)中分离提取的广谱抗生素。CAP已经广泛应用于治疗和预防家禽、家畜及水产品的疾病。然而长期使用可引起再生性障碍性贫血和其他恶性血液病。许多国家严格禁止将CAP用于食品动物(特别是蛋鸡和奶牛)中，规定CAP的最大残留限量为0～10 ng/g。欧盟、美国等均在法规中规定CAP残留限量标准为“零容许量”[1,2]，即不得检出。我国也已经禁止将CAP及其盐、酯用于食品动物。任何水产品、畜禽产品中CAP都是必检项目。因此建立灵敏度高、选择性好、简便易行的动物源性食品CAP残留的检测方法是非常有必要的。目前动物源性食品中CAP的残留分析方法主要有酶免疫分析法[3]、微生物法[4]、高效液相色谱(HPLC)和气相色谱(GC)法[5 - 7]。由于实际样品基质成分复杂，且污染物浓度在ng·g-1或 μg·g-1数量级，样品前处理方法常用液-液萃取和固相萃取(Solid Phase Extraction,SPE)[8]。分子印迹聚合物(Molecularly Imprinted Polymers,MIPs)是一类对特定物质具有特异性吸附的分离材料[8 - 11]。MIPs具有制备简单，选择性好，抗恶劣环境能力强，稳定性高和可重复使用等优点，作为特异性固相吸附剂在复杂基质样品前处理领域得到广泛关注。

虽然已有CAP分子印迹聚合物应用的报道[12 - 14]，但大多数MIPs采用传统本体分子印迹方法，存在识别位点不均一，传质阻力大，选择性差，动力学平衡慢等缺点。本工作以多壁碳纳米管(MWCNTs)为载体，采用溶胶-凝胶的方法先在MWCNTs表面包覆硅层，得到MWCNTs@SiO2，再以氯霉素CAP为模板，采用表面分子印迹技术制备具有核壳结构的CAP分子印迹聚合物包覆的碳纳米管复合材料(MWCNTs@CAP-MIPs)。将MWCNTs@CAP-MIPs作为选择性吸附剂，实现了对鸡蛋样品中痕量CAP的富集和检测。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

热重(TG)分析仪(德国，Netzsch TG 209)；TecnaiG2 T2透射电子显微镜(TEM)(荷兰，飞利浦公司)；AVATAR 360傅立叶变换红外(FT-IR)光谱仪(美国，Nicolet公司)；UV-2450型紫外/可见分光光度计(日本，岛津公司)；LC-20AT高效液相色谱(日本，岛津公司)。CAP的色谱测定条件:使用Shimadzu VP-ODS C18色谱柱(150×4.6 mm，5 μm)；流动相条件为色谱纯甲醇-水(50∶50，V/V)；流速为1.0 mL/min；紫外检测器检测波长为278 nm；进样体积为100 μL。

氯霉素(CAP，上海生工生物工程技术服务有限公司)；碳纳米管购于深圳纳米技术有限公司(直径：60～100 nm，长度：5～15 μm)；四乙氧基硅烷(TEOS)，苯基三甲氧基硅烷(PTMOS)，氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)均购于Alfa Aesar；十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)(天津市光复精细化工研究所)；HNO3(天津市化学试剂五厂)；甲醇，无水乙醇，冰乙酸，乙腈，色谱纯甲醇均购于天津市康科德科技有限公司；氨水(25%)(天津市北方天医化学试剂厂)；其它试剂均为分析纯。所有的实验用水均为高纯水。

1.2 碳纳米管-氯霉素分子印迹聚合物的合成

采用HNO3氧化法对多壁碳纳米管(MWCNTs)进行纯化预处理。参照Gao等[15]的方法，在表面活性剂CTAB存在下，硅烷试剂APTES水解制备SiO2包覆的碳纳米管(MWCNTs@SiO2)。再以CAP为模板，无水乙醇为溶剂，APTES和PTMOS为功能单体，TEOS为交联剂，用溶胶-凝胶法制备碳纳米管-氯霉素分子印迹聚合物MWCNTs@CAP-MIPs。具体制备过程如下：称取一定量的CAP(1.25 mmol) 溶于10 mL乙醇，然后加入功能单体APTES(2.5 mmol)和PTMOS(2.5 mmol)，搅拌0.5 h后加入2 mL TEOS，继续搅拌10 min使溶液混合均匀后，向上述溶液加入200 mg MWCNTs@SiO2和1 mL 1 mol/L HAc，常温下搅拌12 h。反应后的产物先用无水乙醇洗涤三次，干燥。然后用洗脱液甲醇-乙酸(9∶1,V/V)洗脱聚合物中的模板分子，直至洗涤液在275 nm处无紫外吸收。用甲醇洗涤印迹聚合物三次以除去残留的乙酸，最后60 ℃下真空干燥至恒重，即得到印迹聚合物MWCNTs@CAP-MIPs。非印迹聚合物MWCNTs@SiO2-NIPs的合成除不加入模板分子CAP外，其它步骤相同。

1.3 MWCNTs@CAP-MIPs的吸附性能

动力学吸附性能实验：分别称取MWCNTs@CAP2-NIPs 50 mg，置于不同离心管中，然后向每个离心管中加入10 mL 20 mg/L的CAP的乙腈溶液，室温下振荡。每隔一段时间(5、10、15、……60 min)后，取100 μL吸附后的上清液，利用高效液相色谱法测定溶液中CAP的浓度，直到吸附后的溶液浓度值基本无变化为止。

等温吸附实验：分别称取若干份50 mg CAP分子印迹聚合物及非印迹聚合物，置于10 mL的离心管中，然后分别加入3 mL不同浓度的氯霉素的乙腈溶液。室温下振荡2 h，离心，取其上清液，利用高效液相色谱法测定吸附后溶液中氯霉素的浓度。

1.4 MWCNTs@CAP-MIPs应用于鸡蛋样品中CAP的富集

对市场上购买的鸡蛋样品参照Sun等[16]的方法进行前处理。首先将鸡蛋样品制成匀浆，称取3份鸡蛋样品，每份5.0 g，置于50 mL离心管中。将CAP分别以5.0、10.0、30.0 μg/kg的添加水平加入到鸡蛋样品中，然后加入20 mL乙醇-水(6∶4,V/V)溶液，在振荡器上振荡1 h，离心，将上清液转入另一离心管中。再重复提取两次。合并三次提取的上清液，吹干浓缩后，用乙腈定容至50 mL。将30 mg MWCNTs-@CAP-MIPs加入到上述乙腈定容液中，室温下振荡1 h后，离心，弃去上层清液，用甲醇-乙酸((9∶1,V/V)洗脱吸附在MWCNTs@CAP-MIPs上的CAP，用氮吹仪吹干后，流动相定容，再用高效液相色谱法测定吸附后溶液中CAP的浓度。每个添加水平平行测3次。

2 结果与讨论

2.1 MWCNTs@CAP-MIPs的表征

2.1.1透射电镜表征图1为MWCNTs、MWCNTs@SiO2和MWCNTs@CAP-MIPs的透射电镜(TEM)图。由图1可见，MWCNTs的直径约为70～80 nm，硅烷试剂APTES水解后,在MWCNTs表面均匀地包覆了一层SiO2，MWCNTs@SiO2的TEM表明MWCNTs表面包覆层SiO2的厚度约为10 nm，相应粒径增加到约80～90 nm，再经过溶胶-凝胶反应,聚合物层厚度明显增加，说明在MWCNTs@SiO2表面包覆了CAP分子印迹层，TEM图像表明已成功制备了MWCNTs@CAP-MIPs，分子印迹层厚度大约为15 nm。

2.1.2红外光谱表征分别取一定量MWCNTs、MWCNTs@SiO2和MWCNTs@CAP-MIPs，采用KBr压片法，利用FI-IR光谱对其进行表征。从图2中可以看出，经过纯化的MWCNTs表面含有羧基，在3 420 cm-1出现羟基特征吸收峰，且在1 630 cm-1处有-C=O的振动峰；MWCNTs@SiO2在1 070 cm-1处出现Si-O的伸缩振动特征吸收峰，说明在纳米管表面已经包上一层SiO2；而MWCNTs@CAP-MIPs 在1 431 cm-1和1 560 cm-1出现NH2的特征吸收峰，在699 cm-1出现一处苯环的特征吸收峰，且Si-O的伸缩振动峰进一步增强，充分证明了在MWCNTs@SiO2表面接枝上了功能单体，红外数据证实了对MWCNTs的每一步修饰过程都是成功的。

2.1.3热重分析热重分析可以对每步反应的修饰含量加以表征与量化。图3为MWCNTs(a)、MWCNTs@SiO2(b)、MWCNTs@CAP-MIPs(c)的TG图，从图3曲线a可以看出，从0～200 ℃，随着温度的上升，碳纳米管吸附的水分子失去，继续加热到400 ℃，碳纳米管中的杂质组分会不断地分解，失去约4%重量，而在400～580 ℃组分则相对稳定，其含量基本保持不变，随着温度升高到580 ℃以上，碳纳米管开始分解，至700 ℃几乎分解完全。图3曲线b是MWCNTs@SiO2的热分解曲线，碳纳米管包覆一层SiO2后，在200～580 ℃失重约10%，则其损失来自于修饰的硅层部分。图3曲线c是MWCNTs@CAP-MIPs的热分解曲线，前面曲线的下降与曲线b类似，但由于MWCNTs@CAP-MIPs 表面接枝了两种不同的硅烷试剂，在200～580 ℃区间硅层的失重更多，约占总重量的12.5%，碳纳米管升高到580 ℃以上分解完全。TG分析的结果与TEM的分析结果相一致，MWCNTs@CAP-MIPs表面包覆上了硅层和分子印迹聚合物层。

2.2 MWCNTs@CAP-MIPs对氯霉素吸附性能的研究

对MWCNTs@CAP-MIPs进行了动力学吸附考察。从图4a中可以看出，碳纳米管印迹聚合物对模板分子CAP的吸附容量在前20 min增加较快，30 min时基本上已达到吸附平衡。相比于传统的本体聚合制备的CAP-MIPs吸附平衡时间(12～24 h)，本工作所制备的MWCNTs@CAP-MIPs具有优秀的传质特性，印迹层厚约15 nm，印迹位点都在印迹薄层中，保证了较高吸附量的同时，又保证了吸附速率。

MWCNTs@CAP-MIPs和MWCNTs@SiO2-NIP的热力学吸附结果如图4b所示。MWCNTs@-CAP-MIPs吸附容量随CAP溶液浓度增大而迅速增大，而MWCNTs@SiO2-NIPs对模板分子的吸附容量变化很小。MWCNTs@CAP-MIPs和MWCNTs@SiO2-NIP吸附平衡浓度在20 mg/L左右达到平衡。从图4b中可见，对于同一浓度的CAP溶液，印迹材料吸附容量明显高于非印迹材料，前者饱和吸附容量是后者的4.2倍左右。造成这种吸附差异性的原因，这是因为MWCNTs@CAP-MIPs存在较多记忆型的识别孔穴，表现出更高的吸附容量。

印迹聚合物对模板分子的识别选择性用印迹因子(IF)来评价，印迹因子定义为印迹聚合物和非印迹聚合物对模板分子氯霉素的饱和吸附量之比值(QMIP/QNIP)，氯霉素印迹聚合物的印迹因子IF为4.2，说明印迹聚合物对模板分子具有较好的选择性。我们进一步用Langmuir方程来表征MWCNTs@CAP-MIPs对模板分子CAP的吸附性能，Langmuir等温吸附方程如下：

ce/Q=ce/Qmax+ 1/(KDQmax)

(1)

其中,ce(mg/L) 为分子印迹聚合物达到吸附平衡时溶液中模板分子CAP的浓度;Q(mg/g)为达到吸附平衡时分子印迹聚合物对CAP吸附容量，Qmax(mg/g)代表MWCNTs@CAP-MIPs的最大表观吸附容量，KD为解离常数。根据上述方程，通过ce/Q对ce做图，拟合得到一条直线(图4c)，拟合得到的线性方程为：ce/Q=1.037ce+9.956(r2=0.9818)，由直线斜率和截距可计算出Qmax=0.9643 mg/g，KD=0.1042 L/mg。

2.3 MWCNTs@CAP-MIPs的重复使用性能

为了考察MWCNTs@CAP-MIPs的重复利用性能，对其进行了吸附-解吸实验。结果表明，MWCNTs@CAP-MIPs的吸附容量在前三次吸附-解吸循环中，都会比前一次有一定下降，但在第三次吸附-解吸循环后，MWCNTs@CAP-MIPs的吸附容量比第一次降低约15%。这可能是由于在前一次的吸附过程中部分模板分子被吸附在了印迹聚合物的内部，占据了一部分印迹位点，洗脱过程中无法将其洗脱下来，从而使得这部分识别位点不能再吸附新的模板分子，或者是在洗脱过程中印迹聚合物的部分结合位点的空间结构遭到破环，这样造成了聚合物吸附量的逐次降低。对同一印迹聚合物进行了5次吸附-解吸的实验，第5次吸附容量与第一次吸附容量的比值约为82.0%，结果表明MWCNTs@CAP-MIPs可以多次重复使用。

2.4 MWCNTs@CAP-MIPs对鸡蛋样品中氯霉素的富集研究

将MWCNTs@CAP-MIPs材料作为选择性吸附剂应用于鸡蛋样品中CAP的富集，对富集后的MWCNTs@CAP-MIPs用甲醇-乙酸(9∶1,V/V)的溶液洗脱，收集洗脱液定容后用高效液相色谱法测定。对购于超市的鸡蛋样品未检测出CAP残留。为了验证MWCNTs@CAP-MIPs结合HPLC法测定CAP的可靠性，在鸡蛋样品中分别添加5.0、10、30 μg/kg CAP标准溶液，用MWCNTs@CAP-MIPs富集样品中CAP，其平均回收率分别为72.3%、81.6%和84.1%，相对标准偏差(RSD)小于8.5%，回收率和准确性均较好，结果表明MWCNTs@CAP-MIPs适用于复杂样品中痕量CAP的富集和检测。

3 结论

本文发展了一种以多壁碳纳米管(MWCNTs)为载体，以氯霉素为模板，氨丙基三乙氧基硅烷和苯基三甲氧基硅烷为双功能单体，四乙氧基硅烷为交联剂，溶胶-凝胶法制备了核壳结构的氯霉素分子印迹聚合物包覆的碳纳米管复合材料MWCNTs@CAP-MIPs，并进行了吸附性能研究，结果表明MWCNTs@-CAP-MIPs对模板分子具有高的吸附容量，响应动力学快，选择识别性能良好，对鸡蛋样品中的氯霉素的回收率可达72.3%～84.1%，有望应用于实际样品中氯霉素残留量的检测分析。