直接竞争酶联免疫吸附法测定饲料中沙丁胺醇

孙孔飞，曾俊源，刘曙照

(扬州大学环境科学与工程学院，江苏扬州 225127)

沙丁胺醇(Salbutamol，SAL)化学名称为1-(4-羟基-3-羟甲基苯基)-2-(叔丁氨基)乙醇，它是人工合成的水杨醇类选择性β2肾上腺素受体激动剂[1]，临床上用于扩张气管，治疗哮喘。沙丁胺醇在剂量高时可促进动物体内脂肪转化、提高瘦肉率，但易积聚于动物体的内脏、血液和肌肉等组织中。食用含过量沙丁胺醇的动物源食品，会引发人体多种不良反应，危及人的健康安全[2]，因此中国已明令禁止该类化合物用于食品动物生产。

目前，沙丁胺醇的残留检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[3 - 5]、气-质联用法(GC/MS)[6 - 8]、液-质联用法(LC/MS)[9 - 11]、电化学分析法[12]和免疫分析法。免疫分析法包括酶联免疫吸附分析(ELISA)[13,14]、放射免疫分析[15]、金标免疫层析[16]、荧光偏振免疫分析[17]和化学发光免疫分析[18]等。HPLC、GC/MS和LC/MS法对操作技术和仪器设备的要求较高，样品前处理步骤繁琐费时，难以实现大批量样品的现场快速检测[19]。ELISA法简便高效、易普及，可用于大量样品的快速筛查。ELISA法包括间接竞争ELISA法[13]和直接竞争ELISA法[14]。直接竞争ELISA法比间接竞争ELISA法操作时间减少约一半，在实际运用中具有明显优势。目前沙丁胺醇半抗原的合成多采用酸酐与沙丁胺醇的醇羟基或酚羟基反应形成酯键衍生出含羧基末端的连接臂[13,14]，因此连接臂难以定位，半抗原可能存在不同异构体；半抗原中的酯键不够稳定[20]，特别是在免疫动物制备抗体的过程中，易被动物体内的酯酶降解，难以得到单一高效的抗沙丁胺醇抗体。

本实验室采用在沙丁胺醇的酚羟基上通过醚键衍生间隔臂，得到的半抗原(图1)结构单一，稳定性好；采用活性酯法将牛血清白蛋白(BSA)和辣根过氧化物酶(HRP)分别与沙丁胺醇半抗原共价偶联合成免疫原和酶标半抗原[21]。本研究利用所述免疫原免疫新西兰大白兔获得的对沙丁胺醇有高亲和力的多克隆抗体和酶标半抗原，建立包被抗体直接竞争ELISA法，用于测定饲料中的沙丁胺醇，同时采用高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)对沙丁胺醇进行同步分析验证。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Model 680酶标仪(美国,BIO-RAD公司)；DK-S28型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；移液器：5～50、20～200和100～1 000 μL单道手动可调，50～300 μL 8道可调移液器(Dragon Lab)；8孔酶标条(江苏海门爱苯德实验器材有限公司)；XW-80A漩涡混合器(上海青浦沪西仪器厂)；YXQ.SG41.280手提式压力蒸汽灭菌锅(上海华线医用核子仪器有限公司)；Biofuge primo R台式高速冷冻离心机(德国,Heraeus公司)；高效液相色谱仪(美国,Waters公司)。

沙丁胺醇标样(盐城制药厂)；抗沙丁胺醇抗体(本实验室制备，当抗原浓度为0.15 μg/mL时，抗体的ELISA中点效价为0.3 μg/mL)、HRP标记沙丁胺醇半抗原(本实验制备)；包被液：0.02 mol/L、pH=7.6的磷酸盐缓冲液(PBS)；反应液：0.02 mol/L、pH=6.8、含0.05 mol/L NaCl的PBS；洗涤液：灭菌蒸馏水；封闭液(本实验室自制)；显色液：0.2 mmol过氧化脲溶于1 L柠檬酸-磷酸盐缓冲液(8.4 g Na2HPO4、5.2 g柠檬酸溶解于无菌蒸馏水中并且定容至1 L作A液，0.1 g TMB溶于10 mL DMF作B液，用前按VA∶VB=100∶1混匀；终止液：2 mol/L H2SO4；乙腈、甲醇为色谱纯；乙酸溶液：10 mL冰乙酸用无菌蒸馏水稀释至500 mL；淋洗液：移取9 mL浓HCl于1 000 mL灭菌蒸馏水中摇匀；洗脱液：10 mL 25%氨水用甲醇定容至100 mL。

1.2 实验方法

1.2.1直接竞争ELISA法条件优化用0.02 mol/L pH=6.8的PBS将抗沙丁胺醇多克隆抗体分别稀释至3.0、4.0、5.0和6.0 mg/L包被酶标板不同列，酶标半抗原分别稀释2 500、5 000、7 500、10 000倍后加入酶标板不同行，直接ELISA法测定。筛选的标准为抗体和酶标半抗原用量少、酶促显色反应后OD450≈1.0的组合作为进一步建立直接竞争ELISA法的包被抗体-酶标半抗原工作浓度。

在上述选定的工作浓度下，分别用0.02 mol/L pH值为5.6、6.0、6.4、6.8、7.2、7.6和8.0的PBS作为抗体的包被介质，用pH=6.8的PBS作为反应介质稀释酶标半抗原，直接ELISA法测定，根据最终酶促显色反应后OD450值最大确定抗体包被介质的最适pH。

在抗体包被介质最适pH和上述选定的工作浓度下，分别用0.02 mol/L pH为5.6、6.0、6.4、6.8、7.2、7.6和8.0的PBS作为反应介质稀释酶标半抗原，直接ELISA法测定，根据酶促显色反应后OD450最大值确定反应介质最适pH。

在包被介质最适pH和反应介质最适pH及选定工作浓度下，分别用含NaCl浓度为0、0.05、0.15、0.25、0.50、1.0 mol/L 的PBS稀释酶标半抗原，直接ELISA法测定，选择酶促反应后OD450达最大值时的PBS作为直接竞争ELISA最适反应介质。在此基础上进一步筛选包被抗体浓度和酶标半抗原稀释度，作为抗体-酶标半抗原最适工作浓度组合。

1.2.2直接竞争ELISA法的建立将沙丁胺醇标样5.0 mg溶于5 mL甲醇作为储备液，用最适反应介质将标样梯度稀释成浓度为1.0、0.1、0.01、0.001和0.0001 mg/L的系列标准溶液。在最适宜ELISA条件下，测定不同质量浓度沙丁胺醇对抗体-酶标半抗原结合反应的抑制率I[19,21,22]，其计算公式为:I%=[(OD对照-OD沙丁胺醇)/(OD对照-OD空白] ×100%，绘制抑制率I对沙丁胺醇浓度对数(lgc)的标准曲线并建立回归方程，确定沙丁胺醇对抗体-酶标半抗原结合反应的抑制中浓度(Ic50)和Ic10，以Ic10为最低定量检测浓度。

1.2.3样品的提取与净化提取：将猪饲料样品粉碎，准确称取2.0±0.001 g样品于50 mL具塞离心管中，加入16 mL水和2 mL 1 mol/L HCl，振荡混匀。超声5 min，1 mol/L NaOH溶液调节pH至6.8，加水定容至20 mL，混匀，6 000 r/min室温离心5 min，取上清液直接用于ELISA法测定。净化：将混合型阳离子交换小柱固定，依次用5 mL甲醇和5 mL无菌水活化、平衡。移取5 mL上清液于20 mL尖底蒸馏瓶中，55 ℃水浴条件下减压蒸馏浓缩至近干，加入5 mL 2%冰乙酸溶液，涡旋振荡至全部溶解后，加入小柱，控制流速不超过1 mL/min，先用5 mL淋洗液淋洗，再用5 mL甲醇淋洗，最后用5 mL洗脱液洗脱，洗脱液于55 ℃水浴条件下减压浓缩至近干，色谱流动相溶解定容至250 μL，经0.45 μm滤膜过滤，HPLC法测定。

1.2.4HPLC条件色谱柱为C18色谱柱；流动相为甲酸铵溶液∶乙腈=8∶2(V/V)；流速0.8 mL/min；检测波长275 nm；进样体积20 μL。

1.2.5标准加入回收试验直接竞争ELISA工作曲线的建立：用未经净化处理的空白样品提取液将沙丁胺醇标样稀释成质量浓度分别为1、0.2、0.04、0.008、0.0016和0.00032 mg/L的系列标准工作溶液，然后按1.2.2步骤建立ELISA工作曲线。在猪饲料中分别按10、50和250 μg/kg 添加沙丁胺醇，混匀后按1.2.3方法提取，提取离心后的上清液不经净化，直接采用ELISA法检测各样品提取液对抗体-酶标半抗原结合反应的抑制率，根据工作曲线计算添加回收率。将添加250 μg/kg的样品提取液经混合型阳离子交换柱净化，用于HPLC法测定，计算回收率。

2 结果与讨论

2.1 直接竞争ELISA法条件的优化

2.1.1包被抗体-酶标半抗原最适浓度通过两次方阵实验法筛选，结果见图2。当包被抗体浓度为4.0 mg/L、酶标半抗原稀释5 000倍时，二者用量少并且最终酶促显色反应的OD450≈1.0，确定为直接竞争ELISA法的包被抗体和酶标半抗原最适工作浓度。

2.1.2包被介质pH的选择用0.02 mol/L不同pH的PBS将抗体稀释至工作浓度包被酶标板，酶标半抗原亦稀释至工作浓度，直接ELISA法测定的OD450见图3。当包被介质的pH为7.6时，OD450最大，说明此条件下最适合抗体包被，因此选择0.02 mol/L pH=7.6的PBS为抗体的包被介质。

2.1.3反应介质pH的选择用0.02 mol/L pH=7.6的PBS将抗体稀释至工作浓度包被酶标板，用不同pH的0.02 mol/L PBS将酶标半抗原稀释至工作浓度，直接ELISA法检测，最终酶促显色反应OD450见图4。当pH为6.8时，OD450最大，表明抗体-酶标半抗原反应活性最强，故选择pH=6.8。

2.1.4反应介质盐浓度的选择用0.02 mol/L pH=7.6的PBS将抗体稀释至工作浓度包被酶标板，用盐浓度为0、0.05、0.15、0.25、0.5和1 mol/L的0.02 mol/L pH=6.8的PBS将酶标半抗原稀释至工作浓度，直接竞争ELISA法检测，最终酶促显色反应OD450见图5。当盐浓度为0.05 mol/L时，抗体与酶标半抗原反应活性最高，故选择pH=6.8、盐浓度为0.05 mol/L的PBS作为直接竞争ELISA法的最适反应介质。

2.2 沙丁胺醇直接竞争ELISA法标准曲线与回归分析

以沙丁胺醇浓度对数(lgc)为横坐标，沙丁胺醇对抗体-酶标半抗原结合反应的抑制率(I)为纵坐标绘制标准曲线，结果见图6。沙丁胺醇在0.1～1.0×103μg/L浓度范围内与抑制率呈线性相关，其回归方程为:I=23.86lgc+94.20(r=0.9865)，沙丁胺醇对抗体-酶标半抗原反应的抑制中浓度Ic50=14 μg/L，相对标准偏差(RSD，n=5)为8.6%，Ic10=0.29 μg/L。

2.3 猪饲料中沙丁胺醇的测定

2.3.1沙丁胺醇测定的直接竞争ELISA工作曲线及回归分析用空白样品提取液作溶剂配制沙丁胺醇系列工作溶液，在 0.32～1.0×103μg/L浓度范围内，沙丁胺醇浓度对数(lgc)与沙丁胺醇对抗体-酶标半抗原结合反应的抑制率(I)线性相关。经回归分析得回归方程:I=25.629lgc+96.446(r=0.9901)，Ic50=15.4 μg/kg，5次重复测定的RSD为8.8%，Ic10=0.423 μg/kg。

2.3.2ELISA法测定沙丁胺醇残留的回收率在10、50和250 μg/kg添加水平下，直接竞争ELISA法测定的回收率分别为85%～108%、81%～92%、81%～102%，RSD(n=5)分别为9.1%、5.6%、8.9%。结果见表1。

表1 猪饲料中沙丁胺醇标准添加回收率

2.4 猪饲料中沙丁胺醇残留的HPLC测定结果

按1.2.3进行样品的提取与净化，按1.2.4 HPLC条件检测，结果表明。在250 μg/kg的添加水平下，HPLC-UV法测定的平均回收率为89%(n=3)，与直接竞争ELISA法测定结果接近。

3 结论

本实验利用对沙丁胺醇具有高识别能力的多克隆抗体，建立了一种用于快速检测沙丁胺醇的直接竞争ELISA法。ELISA法的样品前处理简单、耗时短，检测费用低，可用于大批量样品的现场快速筛查。与现有间接竞争ELISA法相比，直接竞争ELISA法省去了与二抗反应的步骤，方法更加简便快捷。而与ELISA法相比，HPLC法对样品前处理的要求高，需采用层析净化步骤，花费时间较多。