辫状螺旋碳纳米纤维类酶活性研究及其对三聚氰胺的检测

张鹏程，李亚红，郑 娇，陈继云，陈丹丹，权 英，崔荣静

(常熟理工学院化学与材料工程学院，江苏常熟 215500)

三聚氰胺(Melamine)简称三胺，学名三氨三嗪，它是一种含氮量较高的重要有机化工原料[1]。三聚氰胺本身毒性较低，但是三聚氰胺在生物体肾脏细胞中会形成不溶于水的大分子复合物沉积下来，长期摄入会形成结石，最终导致肾衰竭[2,3]。目前食品和饲料粗蛋白含量通常采用“凯氏定氮法”来测定[4]，因为三聚氰胺的含氮量高达66.6%，而蛋白质中的含氮量只有16%左右[5]，向产品中加入三聚氰胺可以使检测出的蛋白质含量虚高。目前检测三聚氰胺的方法有很多种，传统检测方法有苦味酸法、升华法以及电位滴定法[6]，上述三种方法准确度高，但这些方法都达不到国家对食品中三聚氰胺检测的要求[7]。近些年来发展起来的新检测方法有高效液相色谱(HPLC)法、气相色谱-质谱(GC-MS)联用法、液相色谱-质谱(LC-MS)联用法等[8]，上述的检测方法都有各自的优点，但也存在诸多不足之处，不利于推广使用。

辫状螺旋碳纳米纤维(Plait-like Carbon Nanocoils，CNCs)是一维纳米碳结构的一种特殊形态，它是由碳纳米纤维构成的双螺旋结构。CNCs具有优良的导电性能、较强的催化性能及磁性[9,10]。本文通过合成CNCs并探究其类酶活性，发现该纳米材料具有类似辣根过氧化物酶的催化活性，可以催化TMB与H2O2反应，产生蓝色产物。同时，三聚氰胺可以与H2O2反应生成一种加成化合物[11]，从而消耗体系的H2O2。基于以上研究，建立了一种新的检测三聚氰胺的方法，该方法灵敏度高、操作简易。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

TU-1901双光束紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；KKQ-50E型超声波清洗仪(昆山禾创超声仪器有限公司)；EL204型电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；S-4800扫描电子显微镜(日本，日立公司)；JEM-2100高分辨透射电子显微镜(日本，电子株式会社)。

三聚氰胺(国药集团化学试剂有限公司)，3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB,上海源叶生物科技有限公司)，聚二丙烯基二甲基氯化铵(PDDA,Sigma公司)，其他试剂为国产分析纯。实验用水为超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1CNCs的合成根据文献方法[12]，通过溶胶-凝胶方法制备NiO纳米粒子。称取20 mg的NiO纳米粒子平均分散放入瓷盅后，置入石英玻璃管中，然后在通氢气的环境下425 ℃反应1 h，然后在乙炔氛围中425 ℃反应0.5 h，即可获得产物CNCs。

1.2.2样品使用前的处理称取50 mg螺旋碳纳米管与10 mL的PDDA(1∶100)及NaCl(0.5 mg/mL)的混合溶液混合，超声5 min后，用水超声洗涤5次，将产物配成5 mL溶液，取出2 mL烘干，得其浓度为2.70 mg/mL，剩下的溶液待用。

1.2.3检测方法的建立依次向离心管中加入一定量的三聚氰胺溶液以及H2O2溶液，待反应完全后再依次加入适量的0.2 mol/L乙酸盐缓冲溶液(pH=4.0)、CNCs以及TMB溶液，总体积为3.0 mL，使CNCs、TMB浓度分别为25 μg/mL、200 μmol/L，三聚氰胺的浓度分别为0～70 μmol/L，将混合液放在70 ℃的水浴中反应10 min后冰水浴5 min使反应停止，然后置于TU-1901紫外分光光度计中扫描出400～800 nm的紫外图谱。

1.2.4实际样品前处理实际样品按通用方法进行预处理：称取市售品牌奶粉1.0 g，加入6.5 mL 1% 三氯乙酸溶液和2.2 mL色谱纯乙腈，蜗旋振荡3.0 min，超声5 min，1 3000 r/min离心10 min，取上清用0.45 μmol/L滤膜，以1%三氯乙酸稀释至8 mL，待用。

2 结果与讨论

2.1 辫状螺旋碳纳米纤维的表征

图1A为辫状螺旋碳纳米纤维的扫描电子显微镜(SEM)的形貌图，图1B为CNCs的透射电子显微镜(TEM)图。从图中可以看出制备好的CNCs大部分都具有辫状结构，分别由两个对称的螺旋结构的碳纳米纤维组成，每根螺旋碳纳米纤维的直径大概在70～80 nm之间，其排列规则且分布均匀。

2.2 辫状螺旋碳纳米纤维类酶活性的研究

2.2.1pH值对CNCs催化活性的影响图2(A)为吸光度与pH值的关系曲线，可见当pH值为4.0时催化活性最强，当反应体系为中性或碱性时，催化剂基本不能催化H2O2氧化TMB并产生颜色反应。原因在于，酸性条件下CNCs表现出的是过氧化物酶的催化活性，即CNCs首先催化H2O2产生羟基自由基，同时生成CNCs-自由基复合物，后者与底物 TMB产生颜色反应；在较中性或碱性条件下，CNCs呈现出的是过氧化氢酶的催化活性，即催化H2O2分解产生氧气和水[13]。

2.2.2温度对CNCs催化活性的影响图2(B)为吸光度与温度的关系曲线，当T=70 ℃时，CNCs催化活性最强，故以下实验温度选定为70 ℃。另外，从图中也可以看出CNCs的温度适用范围较广，弥补了HRP酶在温度高于40 ℃时失去催化活性的不足[14]。

2.2.3CNCs浓度对催化活性的影响图3(A)为吸光度与CNCs浓度的关系曲线，当反应溶液中没有CNCs时，吸光度只有0.1，随着CNCs浓度的增大，吸光度增强，当浓度增大25 μg/mL时，吸光度达到最大，因此以下实验CNCs浓度为25 μg/mL。此外，从上图中可以看出，CNCs具有生物酶微量高效的特点。

2.2.4以H2O2为底物时CNCs的表观Km值图3(B)为吸光度与H2O2浓度的关系曲线，从图3(B)可知在一定范围内，体系的反应速率随H2O2浓度的增大而增大，最后趋于平缓，其变化规律符合Michaelis-Menten动力学理论。由图3(B) 可知，体系的反应速率与H2O2浓度在一定范围内呈明显的正相关关系。H2O2的使用浓度过高、过低都会影响检测，为了能准确的检测出三聚氰胺，我们将H2O2的浓度确定为100 μmol/L。图4(A)为吸光度与较低浓度的H2O2的关系曲线，图4(B)为吸光度的倒数与H2O2浓度的倒数的关系曲线，根据米氏常数的求值公式:1/Acat=(1/Amax)+[Km/(Amax·C)]，CNCs对H2O2的米氏常数Km=0.126 mmol/L。该米氏常数较小，说明H2O2对CNCs亲和力较强。

2.2.5以TMB为底物时CNCs的表观Km值图5(A)为吸光度与TMB浓度的关系曲线，从图5(A)可知在一定范围内，体系的反应速率随TMB浓度的增大而增大，最后趋于平缓。图5(B)为吸光度的倒数与TMB浓度的倒数的关系曲线，可得CNCs对TMB的米氏常数Km=0.547 mmol/L。

2.2.6米氏常数对比将CNCs对TMB、H2O2的米氏常数与辣根过氧化物酶(HRP)对其的米氏常数作了对比，如表1中的总结，CNCs对于底物H2O2的Km值比HRP小，说明CNCs对底物H2O2的亲和力高于HRP。但对于另一底物TMB而言，CNCs的Km值比HRP大，说明CNCs对底物TMB的亲和力低于HRP。造成这一现象的原因可能与CNCs本身有关，也可能与我们采用了PDDA处理CNCs有关。采用PDDA处理可以使CNCs表面带上正电荷，而CNCs表面的正电荷有助于吸附更多的羟基自由基[15]，从而提高对H2O2的亲和力；而TMB是一种多氨基化合物，其在酸性缓冲体系中质子化从而带正电荷[16]，由于表面和底物TMB之间存在排斥力，所以降低了对TMB的亲和力。CNCs对底物H2O2亲和力的提高，说明只需要较低浓度的H2O2就可以达到较好的催化效果，有利于三聚氰胺的检测。

表1 表观Km值比较

2.3 三聚氰胺的检测

图6是吸光度与三聚氰胺浓度的关系曲线，三聚氰胺浓度为5～70 μmol/L。通过图5可以得出，三聚氰胺的检出限为1.8 μmol/L，其线性范围为5～70 μmol/L，低于我国制定的三聚氰胺乳与乳制品临时管理值(婴幼儿配方乳粉三聚氰胺限量值为1 mg/kg，液态奶(包括原料乳)、奶粉、其配方乳粉以及含乳15%上其食品中三聚氰胺限量值为2.5 mg/kg)。

2.4 实际样品检测

在牛奶样品中加入不同浓度的三聚氰胺，测其回收率。按照1.2.4进行样品前处理。结果如表2所示，回收率在92%～104%之间。另外我们还测试了氨基酸分子对检测结果的影响，实验结果表明氨基酸分子的存在不会干扰牛奶中三聚氰胺的测定。本方法操作简便、分析时间短，不需要精密复杂的仪器，适用于食品中三聚氰胺的检测。

表2 标准加入法检测牛奶中的三聚氰胺

3 结论

本文合成了一种具有辫状螺旋结构的碳纳米纤维(CNCs)，发现该碳纳米纤维具有高效的类似辣根过氧化物酶(HRP)的催化活性，同时在较大的酸碱范围以及温度范围内都保持较高的催化活性，有着HRP不可比拟的优势。同时，根据三聚氰胺可以与H2O2反应生成一种稳定的加成化合物，建立了一种新的检测三聚氰胺的方法，其检出限达到了1.8 μmol/L。该方法简单、快速、灵敏度高，有希望应用于三聚氰胺的实际检测，在食品安全检测方面有着巨大的应用价值。