高效液相色谱-电感耦合等离子质谱分析烟草中硒形态

李登科，范国樑，叶鸿宇，姚鹤鸣，陆怡峰,张春涛，马立超，邢立霞*

(1.上海烟草集团有限责任公司技术中心天津工作站,天津 300163；2.天津大学材料科学与工程学院,天津 300072；3.上海烟草集团有限责任公司技术中心,上海 200082)

硒是人体的必需微量元素之一，在体内发挥着抗氧化、保护细胞膜的作用，还具有提高机体免疫力、消除重金属积累等生理生化功能[1]。硒化合物的毒性及有益性取决于其浓度与存在的化学形态[2]。硒在自然界和生物体中有多种形态，其中毒性较大的有硒酸盐Se(Ⅵ)、亚硒酸盐Se(Ⅳ)，与人体代谢密切相关的有硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒脲(SeUr)等[3]。目前，硒形态测定方法有气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)[4]、原子荧光光谱法[5]、高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)[6]、电化学法[7]、高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)[8]。

高效液相色谱-电感耦合等离子质谱(HPLC-ICP-MS)具备诸多优点，如：检测限低、线性范围宽、分离步骤少、分离程序快、保持元素原有形态被直接检测等，能够极大提高分析效率，具有很强的实用性[9]。目前关于砷、硒、铬、汞等元素形态分析的研究工作已见诸报道[10 - 13]。但在目前的相关报道中，烟草中硒的形态分析研究很少。本文采用HPLC-ICP-MS法建立了烟草中硒元素的形态分析方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

1260-7700x型高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱仪(美国，Agilent公司)；Milli-Q超纯水仪(美国，Millipore公司)；KQ600-DE超声波清洗器(昆山超声)；Z300高速离心机(德国，Hermle公司)；s220k pH计(瑞士，Mettler公司)；0.45 μm纤维素滤膜(上海安谱)。

HCl(分析纯，天津科密欧)；柠檬酸(CNW公司)；氨水(分析纯，天津科密欧)；硒代胱氨酸、亚硒酸根、甲基硒代半胱氨酸、硒酸根、硒脲、硒代蛋氨酸6种物质的标准品(上海安谱)。Milli-Q超纯水。

烟草样品由天津卷烟厂提供。

1.2 样品前处理

将烟草样品在温度22±1 ℃，相对湿度60%±2%恒温恒湿箱中平衡24 h，加工磨细至100目，取1.0000 g烟草样品，加入10 mL 0.10 mol/L的HCl，超声萃取30 min后移至离心管中，在3 500 r/min条件下离心20 min，取上层清液过0.45 μm纤维素滤膜，待HPLC-ICP-MS分析[11]。

1.3 仪器条件

HPLC条件：保护柱(填料为苯乙烯-二乙烯基苯聚合物，Hamilton公司)；硒形态分析柱(Hamilton PRP X-100阴离子交换柱)；流动相为20 mmol/L柠檬酸溶液，用氨水调节pH=7.0，流速1.2 mL/min，进样体积100 μL。

ICP-MS条件：RF入射功率1 550 W，RF匹配电压1.8 V；同心圆雾化器，载气为高纯氩气，等离子体气体流速15.0 L/min，载气流速1.02 L/min，He碰撞模式，碰撞气流速0.90 L/min；蠕动泵转速0.36 r/s；采样深度8 mm；检测质量数m/z=78(Se)，停留时间为0.5 s(m/z=78)。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1流动相及其浓度的选择考虑到待测目标硒化合物的理化性质，本实验选择柠檬酸溶液作为流动相。分别选取10、15、20和25 mmol/L的柠檬酸溶液作为流动相，考察流动相浓度对6种硒元素形态分离的影响，如图1。结果表明，当流动相浓度较低时，分离时间较长，色谱峰形会有比较明显的展宽，分离度较低；随着流动相浓度的不断增大，分离时间逐渐减小，峰形趋于对称，分离度均较好。综合考虑分析时间、分离度因素，最终选择20 mmol/L的柠檬酸溶液为流动相。

2.1.2流动相pH值对硒元素形态分离的影响分别考察了流动相pH值对6种硒元素形态分离的影响，如图2。结果表明，硒酸根的保留时间随流动相pH值的增大有明显的减小趋势，硒代胱氨酸和甲基硒代半胱氨酸的保留时间在pH值超过7.0时才会有所增加，其余形态的保留时间受pH值变化影响较小。综合保留时间和分离度，在pH=7.0时具有最佳分离效果，且总的分离时间约5.5 min。在该条件下，出峰顺序依次为：硒代胱氨酸、亚硒酸根、甲基硒代半胱氨酸、硒酸根、硒脲、硒代蛋氨酸。

2.1.3流动相流速对硒元素形态分离的影响流动相流速对于不同形态硒元素的保留时间同样具有影响。考察了流速分别为0.8、1.0、1.2和1.5 mL/min时对硒形态分析的影响，如图3。当流速较低时，分离时间过长，且色谱峰形会有明显的展宽，分离度较低；当流速过高时，出峰最早的硒代胱氨酸与亚硒酸根又会出现峰形重叠的现象，分离度变小；同时在高流速下会加速色谱柱的流失，影响色谱柱的寿命和柱效。综合考虑，选定流动相流速为1.2 mL/min。

2.2 样品前处理方法的研究

2.2.1萃取溶液的选择稀HCl可以提取烟草样品中大部分无机态硒，而蛋白酶则可以将样品中的有机态硒水解，提高某些有机态硒的回收率[14,15]。因此实验分别采用稀HCl、蛋白酶(from 灰色链)溶液、蛋白酶K(from 林伯式白色念球菌)溶液作为烟草样品萃取溶液，对烟草中硒元素进行萃取/酶解。结果表明，以稀HCl为萃取溶液，能够达到更好的萃取效果。加入蛋白酶/蛋白酶K并没有实现有机态硒的水解，而蛋白酶/蛋白酶K的水溶液对无机态硒的萃取能力也弱于稀HCl。而采用0.10 mol/L HCl萃取时，除硒酸根与亚硒酸根外，还可以检测出其他有机态硒，因此选用其作为萃取溶液。

2.2.2萃取液用量的选择称取1.0000 g烟草样品，分别加入10、20、30、40和50 mL 0.10 mol/L HCl对烟草样品进行样品前处理，上机测定后计算萃取效率。结果表明，萃取液体积大于20 mL时，可以对硒酸根和亚硒酸根进行定量，且萃取效率基本保持不变。但如果萃取溶液体积过高，会使硒形态响应降低而难以定量。当萃取液为10 mL时，可以同时对硒代胱氨酸与甲基硒代半胱氨酸等有机态硒进行定量，提高总体萃取效率。若萃取溶液体积进一步降低，则很难将烟草样品完全浸没，从而影响萃取。实验选用10 mL稀HCl作为最佳萃取液体积。同时对萃取液浓度进行考察，选用0.05、0.10、0.20、0.30、0.40 mol/L HCl作为萃取液，结果表明，采用0.10 mol/L HCl，对样品中硒元素的萃取效率最高。

2.2.3萃取方式与萃取时间的优化通过对比超声、恒温水浴振荡、超声加水浴振荡等不同的样品提取方法，发现超声萃取效果高于单纯的振荡提取，与超声加水浴振荡相结合的方法结果也没有明显差别，因此选用超声萃取作为样品萃取方式。同时考察不同超声时间对硒元素提取效率的影响，发现30 min超声能够较好地保证样品萃取效率。

通过上述各样品前处理条件的优化，形成的样品前处理方法如文中“1.2”所述，在此条件下，样品的萃取效率在72%左右，较仲娜等[11]中同样使用稀HCl萃取富硒产品的萃取效率有所提高，但低于倪张林等[16]中使用蛋白酶提取富硒蔬菜的萃取效率。推测烟草中基质比较复杂，单纯的添加蛋白酶并不能使烟草中的有机态硒水解出来，或烟草中存在其他形式的难以解离出的硒形态，在既定检测方法下无法测定，从而影响方法的萃取效率。

根据优化的样品分析方法，对烟草样品进行硒元素形态测定。6种硒形态的标准溶液色谱图如图4所示。烟草样品色谱图如图5所示。

2.3 方法分析性能

该方法对不同硒元素形态的分析性能列于表1。由表1可见，各硒元素形态标准曲线线性良好，检出限为0.13～3.25 ng/mL。同时采用最低浓度的硒形态混合标准溶液连续进样10次，计算各硒元素形态浓度值的相对标准偏差(RSD)，结果均小于3%，表明方法的精密度良好。

表1 6种硒元素形态的线性回归方程和方法检出限

Comment:y-peak area of selenium species,x-concentration of selenium species.

2.4 加标回收率的测定

向烟草样品中分别添加不同浓度的硒形态标准溶液，并参考“1.2”中的样品前处理步骤，测定加标样品结果，并与样品本底值对照，计算加标回收率，结果如表2所示。由表2可知，各硒形态的加标回收率介于86.1%～95.8%，该方法适用于烟草中硒元素形态分析。

表2 烟草样品中硒元素形态加标回收率结果(n=3)

2.5 实际样品测定

随机选取三种市售卷烟，取其烟丝部分，按“1.2”方法进行样品前处理，并按“1.3”方法进行样品分析。每一个样品平行测定三次，取其平均值作为样品中硒元素形态测定结果。结果如表3所示。

表3 实际样品硒形态含量测定结果(n=3)

ND:not detected.

3 结论

依据建立的HPLC-ICP-MS方法考察了烟草中硒元素的形态分布特征，结果表明无机态的亚硒酸根与硒酸根含量较高，而有机态的硒中甲基硒代半胱氨酸含量相对较高。鉴于不同形态硒元素对生物体的作用差异较大，因此基于硒元素的形态分析结果的安全性评价比基于硒元素总量的安全性评价更加科学、合理。