Tb3+配合物修饰的磁性纳米荧光探针对水中Cu2+的超灵敏检测

马治国，刘 静，汪宝堆*

(1.兰州大学化学化工学院，甘肃兰州 730000;2.张家川回族自治县第二中学，甘肃天水 741506)

当前重金属污染对环境和人类健康造成了严重威胁，因此设计合成一系列多功能的纳米探针,借此高灵敏、高选择性识别环境和生物体内的金属离子显得非常重要，适量的Cu可以维持人体中一些酶的生物过程以及调节人体的一些重要生理活动，但是过量的Cu会对人体产生非常严重的影响，比如会造成神经性疾病如老年痴呆症和帕金森症等，还会引起肌肉萎缩性疾病，并对肠胃和肾脏构成损害。Cu对环境水体的污染会影响江河水通过化学或生物降解的方式进行自净化的能力[1]。因此，监测水中Cu2+对于预防环境污染和保持人体健康都是十分重要的。目前，Cu2+的检测方法有原子吸收/发射光谱、电感耦合等离子质谱和一些电化学的方法[2,3]。但是这些方法由于需要昂贵的仪器和复杂的样品前处理步骤，因此其应用受到了限制。而最近几年发展起来的荧光检测方法，因为其灵敏度高、响应速度快、操作简便等优点受到了人们的青睐[4]。

近年来,用来检测Cu2+的荧光探针大部分是一些小分子有机荧光染料,由于这些荧光染料水溶性较差，容易发生光漂白现象[5]，其应用时灵敏度和选择性受到限制。与传统的有机染料相比，镧系配合物具有许多优良的性质，如窄带发射、大的Stokes位移、长的荧光寿命和高的量子产率[6]。稀土配合物作为荧光探针可以检测阳离子、阴离子和生物分子[7,8]。随着纳米技术的发展，将具有特异性识别功能的荧光分子和纳米粒子复合而成的新的探针，由于纳米粒子对荧光分子的聚集作用使荧光信号进一步放大，可以超灵敏检测金属离子。同时，荧光分子和顺磁性纳米粒子复合成的荧光探针对金属离子还具有富集和分离功能[9 - 11]。

本研究将Tb3+的发光配合物,通过聚乙二醇衍生物修饰在磁性Fe3O4纳米粒子表面，该纳米探针在水溶液中能够发出很强的Tb3+特征荧光。研究发现，当Cu2+加入该探针所形成的溶液后，由于其与探针中的有机分子具有强的结合能力，导致Tb3+被Cu2+取代，纳米探针的荧光被淬灭，从而实现了对Cu2+的超灵敏、高选择性检测。此工作的开展对今后在环境和生物体中金属离子的检测提供了一种新的思路和方法。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

Philips EM 420场发射透射电子显微镜(TEM)(美国，飞利浦公司)；RF-5301荧光分光光度计光谱仪(日本，岛津公司)。

7-氨基-4-甲基喹啉酮(cs124)、 聚乙二醇(PEG,MW=4 000)、3,4-二羟基苯甲醛,均购自Sigma-Aldrich公司。参照文献方法合成Fe3O4纳米粒子[12]，二乙三胺五乙酸酐(DTPAA)[13]，1,ω-PEG二胺(NH2-PEG -NH2)[14]，3,4-二羟基苯甲醛-PEG -胺(DBI-PEG -NH2)[15]，Fe3O4-DBI-PEG -NH-DTPA-cs124∶Tb3+[16]。TbCl3·6H2O是将Tb4O7溶于HCl并不断蒸发掉过量的酸，然后缓慢滴加30%H2O2，蒸发烘干析出固体。

1.2 cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb复合荧光探针的合成

1.2.1DTPA-cs124的合成35.7 mg(0.1 mmol)DTPAA 加入5 mL DMF中，室温搅拌直至澄清，然后加入100 μL 干燥的三乙胺。17.4 mg cs124(0.1 mmol)溶于2 mL干燥DMF中，然后将cs124的溶液缓慢滴加到DTPAA溶液中，混合后常温搅拌10 h。反应结束后，加入乙醚沉淀析出产物DTPA-cs124，将得到的产物真空干燥，低温避光保存。

1.2.2cs124-DTPA-NH-PEG-DBI的合成将10 mL溶有DTPA-PEG -DBI(400 mg，0.1 mmol)干燥CH2Cl2溶液缓慢滴加入上述DTPA-cs124的DMF溶液中，待溶液滴加完毕后，常温下搅拌24 h。往反应完毕后的溶液中加入乙醚沉淀出产物后4 000 r/min离心，固体用少量CH2Cl2/DMF/乙醚(1/1/5，V/V/V)洗涤3次，产物真空干燥，低温避光保存。

1.2.3cs124-DTPA-NH-PEG-DBI∶Tb的合成37.4 mg(0.1 mmol)TbCl3·6H2O用乙醇溶解后，缓慢滴加到等摩尔量的cs124-DTPA-NH-PEG -DBI的溶液中，待液体滴加完毕后，常温下搅拌12 h。反应完毕后加入乙醚沉淀出产物，4 000 r/min离心，固体用少量CH2Cl2/DMF/乙醚(1/1/5，V/V/V)洗涤3次，产物真空干燥，低温避光保存。

1.2.4cs124-DTPA-NH-PEG-DBI-Fe3O4∶Tb的合成在Fe3O4纳米粒子的正己烷存储液中加乙醇离心得到固态Fe3O4纳米粒子，真空干燥后称取20 mg，用5 mL CHCl3分散，cs124-DTPA-NH-PEG -DBI∶Tb(100 mg)溶于10 mL CHCl3，将Fe3O4的氯仿溶液缓慢滴加到cs124-DTPA-NH-PEG -DBI∶Tb，室温下搅拌24 h。待反应结束后加石油醚沉淀出产物，4 000 r/min离心，固体用少量乙醇/DMF/石油醚(1/1/5,V/V/V)洗涤3次，产物再分散在水中，透析24 h除去游离的有机物，透析后低温避光保存。

2 结果与讨论

2.1 Tb3+配合物修饰磁性纳米荧光探针对Cu2+的检测原理

设计合成的Tb3+配合物修饰磁性Fe3O4纳米复合荧光探针cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb，其中配合物的发光是基于“天线效应”，即7-氨基-4-甲基喹诺酮(cs124)作为吸收光源的天线分子，氨基多羧酸螯合剂(DTPA)与Tb3+配位后，通过分子内的能量转移，cs124将吸收的能量传递给中心的Tb3+，敏化增强了Tb3+的发光，从而使cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb复合荧光探针表现Tb3+的特征光谱。Fe3O4磁性纳米粒子表面修饰有PEG聚合物，使得整个复合荧光探针的水溶性良好，能够实现在水溶液中对金属离子的荧光检测。

氨基多羧酸螯合剂有良好的水溶性，而且与Cu2+有很高的结合常数[16]。实验中发现，在Cu2+存在下cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb的荧光猝灭，并且该纳米探针可用于Cu2+的超灵敏和专一性检测，检测限可低到1 nmol/L。因此我们推测，Tb3+与Cu2+和配体DTPA的结合常数不同，可发生离子交换后生成非荧光的纳米复合物。即cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb复合荧光探针中的Tb3+被Cu2+置换，形成非荧光物质cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Cu，导致Tb3+的特征荧光猝灭，并且荧光强度的变化与Cu2+的浓度变化有关。复合荧光探针检测Cu2+的原理见图1。

透射电镜(TEM)(图2)显示，磁性Fe3O4修饰前后粒径形貌几乎没有变化，表明此方法修饰合成的纳米荧光复合物具有良好的稳定性。

2.2 pH对cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb检测Cu2+的影响

为拓展这种探针对Cu2+检测的适用范围，分别测试了无Cu2+、含11 μmol/L Tb3+的cs124-DTPA-NH-PEG -DBI∶Tb、含11 μmol/L Tb3+的cs124-DTPA-NH-PEG -DBI∶Tb和10 μmol/L Cu2+，于不同pH值下，在发射波长为545 nm下的荧光强度。pH值(3.0～11.0)用HCl或NaOH溶液调节。从图3可以看出，cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb的荧光强度(图3a)在pH=5.0～10.0范围内较稳定。而cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb 与Cu2+作用后的荧光强度(图3b)在pH=4.0～10.0范围内较稳定。因此，探针以及探针检测金属离子的过程在较宽pH范围(5.0～10.0)内是稳定的。说明该探针可以实现对实际样品中Cu2+的检测。

2.3 反应时间对cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb检测Cu2+的影响

作为一个能实际使用的荧光探针，除了高的灵敏度和选择性外，其对分析物的响应时间也是衡量其性能优越的一个重要指标。在Tris-HCl缓冲溶液中，测试10 μmol/L Cu2+溶液和含11 μmol/L Tb3+的cs124-DTPA-NH-PEG -DBI∶Tb混合后，于不同反应时间下cs124-DTPA-NH-PEG -DBI∶Tb的荧光强度。由图4可以看出，cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb对Cu2+响应时间迅速，在大约1.5 min的时间内，探针与Cu2+的响应就能够达到平衡。

2.4 cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb的荧光滴定及对Cu2+的检测限

为了验证所合成的纳米探针在水溶液中对Cu2+的检测能力，把不同量的Cu2+加入到cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb(11 μmol/L Tb3+)的水溶液中。从图5可以看出，在水溶液体系中，随着Cu2+的浓度(1 μmol/L至100 μmol/L)不断增大，cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb的荧光猝灭，发射峰强度不断降低。且 Cu2+的浓度在1～15 nmol/L范围时(图5)，cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb在发射波长为545 nm下的荧光强度对Cu2+的浓度线性关系良好，线性方程为:y=518.34-1.68x,相关系数R2=0.9698，因此，cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb对Cu2+的检测限可达到1 nmol/L。此检测限明显低于美国环保局规定的Cu2+的最低浓度。

2.5 cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb的离子选择竞争

为了证明此探针在其他离子存在下对Cu2+仍然有很高的选择性，在含Tb3+为11 μmol/L 的cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb的溶液中，加入100 μmol/L Cu2+和100 μmol/L其他阳离子，检测cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb在每种离子存在时在发射波长为545 nm下的荧光强度变化。图6中黑色棒状数据显示的是cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb对各种离子的选择性。从图中可以看出，每一种金属离子单独加入到该纳米探针溶液后，只有Cu2+能够较多的猝灭该探针，而其他离子的对探针猝灭较小。当将Cu2+加入到其他金属离子和探针的混合溶液后，得到的数据用灰色棒状表示，发现探针的荧光强度降低，因此，相对其他阳离子来说，cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb对Cu2+选择性好。说明此探针在有其它离子存在时，对Cu2+的检测具有很强的抗干扰能力。

3 结论

本文合成了一种稀土Tb3+配合物修饰的磁性Fe3O4纳米复合荧光探针(cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb)。该探针可以选择性地检测水中Cu2+。且这一纳米探针可在较宽的pH范围(5～10)内稳定检测Cu2+，灵敏度高，检测限达到1 nmol/L。基于以上特点，该探针对环境中污染物的检测和除去，以及生物体系中的分析和检测中有十分广泛的应用前景。