高效液相色谱法测定美白面膜中7种荧光增白剂

余佩佩,程 俊，顾 华，余肖峰，邵超英*

(1.东华大学化学化工与生物工程学院，上海 201620；2.国土资源部上海资源环境监督检测中心，上海 200072)

荧光增白剂(Fluorescent Whitening Agents，FWAs)被广泛用于纸制品、纺织品及洗涤剂等产品中以提高产品的白度和光泽度。有报道指出，使用含有荧光增白剂的洗涤液或纸制品，会导致皮肤上荧光增白剂的残留[1,2]。这些荧光剂与人体中的蛋白质结合，会加重肝脏负担、造成血液系统受损、甚至导致细胞变异，具有潜在的致癌性。因此，我国对纸制品、餐具洗涤剂等产品中荧光增白剂的使用进行了严格监管，并制定了相关规范与标准[3,4]。然而，在日用护肤化妆品[5]及面膜[6]等产品的卫生规范中均未明确禁止荧光增白剂的使用，也未出台相关的标准检测方法。一些不良商家在美白面膜中恶意添加荧光增白剂，以达到一敷即白的效果，给人类健康带来潜在威胁。因此，研究面膜等护肤产品中荧光增白剂的检测方法，对相关机构加强化妆品产品的质量监督管理和保障消费者身体健康具有重要意义。

目前，荧光增白剂的检测方法主要有紫外灯照射观测法[7]、荧光分光光度法[8]、高效液相色谱-荧光检测(HPLC-FLD)法[9 - 11]、液相色谱-质谱(LC-MS)法[12 - 14]等。其中，紫外灯照射观测法仅限于荧光剂的定性试验；荧光分光光度法只能定量测定荧光物质的总量；而色谱法是分析种类繁多、成分复杂的荧光增白剂的重要手段。与仪器设备昂贵、检测成本高的液-质联用法相比，HPLC法的应用更为广泛。Shu等[9]使用TBA离子对试剂和液相色谱法分析了洗涤剂及表层水中的荧光增白剂；焦艳娜等[10]及吴钟玲等[11]均建立了测定食品接触材料中荧光增白剂的反相HPLC-FLD法。而关于化妆品中荧光增白剂的测试方法研究尚未见报道。

根据市场上荧光增白剂的使用情况，本文选择了7种具有代表性的荧光增白剂:4,4′-双[(4-苯胺基-6-羟乙基氨基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2,2′-二磺酸二钠盐(FWA 85)、4,4′-双(2-磺酸钠苯乙烯基)联苯(CBS 351)、4,4′-双[(4-苯胺基-6-吗啉基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2,2′-二磺酸二钠盐(FWA 71)、4,4′-双(苯并噁唑-2-基)二苯乙烯(FWA 393)、4,4′-双(2-甲氧苯乙烯基)联苯(FWA 378)、4,4′-双(5-甲基-2-苯并噁唑基)二苯乙烯(FWA 368)、2,5-双(5-叔丁基-2-苯并噁唑基)噻吩(FWA 184))作为研究对象，建立了美白面膜中上述7种荧光增白剂的灵敏、准确的HPLC-FLD分析法。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国，Agilent公司)，配荧光检测器(FLD)及色谱工作站；MinPlus型涡旋混合器(合肥艾本森科学仪器有限公司)；DS-2510DTH型超声波清洗机(上海生析超声仪器有限公司)；TD5A-WS型台式离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；BSA224S-CW型电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)。

荧光增白剂标准品均购自上海安谱科学仪器有限公司。其中，FWA 85和FWA 71荧光强度100%；CBS 351和FWA 393的纯度≥97.0%；FWA 184的纯度≥98.0%；FWA 368的纯度≥95.0%；FWA 378的纯度≥90.0%。甲醇、乙腈(赛默飞世尔科技有限公司)、乙酸铵(德国CNW公司)为色谱纯试剂；其他试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。实验用超纯水由Hi-tech KFLOW型超纯水机(上海和泰仪器有限公司)制备。

实验所用美白面膜购自上海市某超市。

1.2 标准溶液的配制

准确称取各荧光增白剂标准品10.0 mg(精确至0.1 mg)，其中FWA 85、FWA 71和CBS 351分别用甲醇溶解并定容至100 mL，FWA 393、FWA 184、FWA 368和FWA 378分别用三氯甲烷溶解并定容至100 mL，配制成100 mg/L的各荧光增白剂单标标准储备液。上述标准储备液于4 ℃避光冷藏保存。

1.3 样品前处理

称取美白纸质面膜精华液1.0 g(精确至0.1 mg)于50 mL具塞比色管中，加入15 mL乙腈，涡旋混合1 min后，于温度30 ℃下超声提取20 min，冷却至室温后用甲醇定容，摇匀。取部分溶液于50 mL聚丙烯离心管中，以5 000 r/min离心10 min，取上清液过0.45 μm有机滤膜，待HPLC-FLD测定。

1.4 液相色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(150×4.6 mm，5 μm)；流动相：A：25 mmol/L乙酸铵溶液，B：甲醇；梯度洗脱程序：0.0 min，60%A+40%B；20.0 min，20%A+80%B；21.0 min，5%A+95%B；40.0 min，5%A+95%B。进样量：5 μL；流动相流速：1.0 mL/min；柱温：20 ℃；荧光检测器：激发波长365 nm，发射波长430 nm。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

2.1.1提取溶剂及其用量选择由于荧光增白剂具有较强极性，实验分别考察了N,N-二甲基甲酰胺、乙腈、甲醇、乙醇作为提取剂对样品中7种荧光增白剂的超声萃取效率。图1的结果表明，乙腈对7种待测物有较高的提取率。进一步比较了不同乙腈用量条件下7种荧光剂的回收率。由图2可知，随着乙腈用量的不断增加，FWA 85的提取率逐渐降低，同时FWA 393、FWA 368呈现较大误差，因此实验选择使用15 mL的乙腈作为提取剂。

2.1.2超声萃取条件选择分别考察了不同超声时间和萃取温度条件下乙腈对7种荧光增白剂的提取效率。实验结果表明，开始时荧光增白剂的萃取率随超声时间的增加上升，超声时间为20 min时达到最高值；而后基本保持不变或下降。经实验证明提取温度对荧光增白剂的提取率影响不大，因此将超声萃取条件确定为温度30 ℃条件下提取20 min。

2.2 液相色谱条件的优化

2.2.1荧光测试条件选择分别对待测荧光物进行多激发和多发射扫描试验，扫描范围200～800 nm，步进值为2 nm，结果见表1。由表1可见，7种荧光增白剂的最大激发波长为360～367 nm，最大发射波长为420～436 nm，故选择λex=365 nm、λem=430 nm。

表1 7种荧光增白剂的最大激发波长和最大发射波长

2.2.2流动相的选择反相高效液相色谱常用甲醇-水或乙腈-水作为流动相。本实验中为改善FWA 85和FWA 71的色谱峰拖尾情况，在流动相中加入25 mmol/L乙酸铵。分别考察了甲醇-乙酸铵和乙腈-乙酸铵两种流动相条件下7种荧光增白剂的分离情况。乙腈-乙酸铵作流动相时，FWA 85和CBS 351、FWA 393和FWA 378未获得完全分离，且分析时间较长，故选择甲醇-25 mmol/L乙酸铵体系作为流动相。进一步对梯度洗脱程序进行了详细优化，7种待测物在38 min内获得满意分离。7种荧光增白剂的标准色谱图见图3。

2.2.3进样量的选择通常，荧光物质的荧光强度随其浓度的升高而下降，甚至发生猝灭。实验分别考察了进样量5 μL和10 μL条件下荧光增白剂的荧光强度。发现当进样量为10 μL时，CBS 351、FWA378、FWA 184的荧光信号显著下降。故选择进样量为5 μL。

2.3 工作曲线、检出限与定量限

在已确定的实验条件下，对不同质量浓度的7种荧光增白剂系列混合标准工作液进行测定，绘制标准曲线，见表2。实验表明，FWA 85和FWA 71以及其他5种荧光增白剂分别在5～35 mg/L和0.025～4 mg/L的浓度范围内呈良好的线性关系，线性相关系数均大于0.991。以信噪比(S/N)=3及S/N=10所对应的被测化合物的含量作为方法的检出限(LOD)及定量限(LOQ)，7种荧光增白剂的仪器检出限为0.00071～0.18 mg/L，定量限为0.12～12.24 μg/g。方法具有较高的灵敏度。

表2 7种荧光增白剂的线性方程、线性相关系数、方法的检出限和定量限

2.4 准确度及精密度

方法的准确度用样品的标准加入回收率进行评价。取阴性美白面膜样品进行3个水平的加标回收试验，每个水平平行测定6次，加入回收率和相对标准偏差(RSD)结果见表3。结果显示，7种荧光增白剂的加标平均回收率在93.62%～115.87%之间，RSD为0.43%～5.40%。表明方法具有良好的准确度与精密度。

表3 7种荧光增白剂的方法回收率和精密度(n=6)

2.5 实际样品测定

应用本方法对市售的8种品牌美白面膜进行了测定，上述7种荧光增白剂均未检出。

3 结论

本文根据美白面膜样品的特性，建立了以超声萃取技术为主的前处理方法，7种目标化合物获得了较高的提取效率；并通过优化色谱条件，建立了同时测定美白面膜中7种荧光增白剂的高效液相色谱-荧光分析法。该方法前处理简单、结果准确、灵敏度高，能够满足7种目标化合物的定性定量分析，可为化妆品中荧光增白剂的分析测定提供科学参考。