颅痛定对心肺复苏患者血清NO及CO浓度的影响

陈齐国，何彩霞，何 奇

（湖南师范大学附属长沙医院，长沙市第四医院，长沙 410006）

颅痛定对心肺复苏患者血清NO及CO浓度的影响

陈齐国，何彩霞，何 奇

（湖南师范大学附属长沙医院，长沙市第四医院，长沙 410006）

目的：观察心肺复苏成功患者血清NO和CO浓度的变化以及颅痛定对这种变化的影响。方法：把患者随机分为治疗组（20例）和对照组（15例），从心跳骤停到开始复苏时间以15分钟为界进一步把治疗组和对照组分为早期组和晚期组。于心肺复苏成功后第6h、24h、48h、72h抽取病人外周静脉血，用硝酸还原酶法测定血清NO含量，可见分光光度计法测定CO含量。结果：心肺复苏后6h血清NO浓度上升，24h达高峰，随后又下降，48h降到低谷，然后再次上升。颅通定表现出对NO产生的抑制作用，早期治疗组和对照组NO含量变化曲线几乎平行，两组NO含量差别在6h、24h无显著性，在48h、72h有显著性。晚期治疗组与对照组NO浓度变化方向几乎相反，颅通定也表现出对NO生成的抑制作用，但与对照组无平行关系。晚期治疗组和对照组中任何时间段血清NO含量的差别均无显著性。早期对照组的CO浓度在复苏后6h下降，24h降到低谷，48h略有上升，后又再次下降。而治疗组CO浓度在复苏后6h开始上升，随后急剧下降，48h达到低谷，然后再次上升。早期治疗组和对照组的CO浓度变化曲线几乎呈相反方向。晚期对照组CO浓度在复苏后6h急剧下降，24h降到低谷，随后一直上升。颅通定表现出对CO生成的抑制作用，治疗组从复苏后6h到72h几乎呈直线下降趋势。但无论是早期组或晚期组在各个时间点之间CO浓度差别均无显著性。结论：颅通定可能通过调控心肺复苏患者体内NO含量发挥抗脑缺血再灌注损伤作用，且在早期复苏（≤15min）患者中作用更明显。而颅通定对心肺复苏患者体内CO含量的影响不明显。

颅痛定；一氧化氮；一氧化碳；心肺复苏；脑缺血-再灌注

颅痛定（L-tetrahydropalmatine，L-THP））是中药延胡索中提取的生物碱，其药理作用主要是镇静、镇痛。后来人们相继发现了其抗心律失常和脑保护作用，并对其作用机制开展了广泛的动物研究，某些研究已经证实颅通定可降低局灶性脑缺血组织中一氧化氮（Nitric oxide，NO）的含量，其脑保护机制之一是通过抑制NO介导的神经毒性作用而实现的［1］。同时，还有研究证实颅通定可通过抑制脑缺血/再灌注大鼠脑组织内血红素氧化酶-1（hemeoxygenase-1，HO-1）的活性使一氧化碳（Carbon monoxide，CO）和环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）水平下降，减少神经元丢失，减轻脑缺血/再灌注损伤［2］。另外，国内外均有学者研究发现血浆CO和NO的水平与新生儿缺血缺氧性脑病的严重程度、脑损伤以及神经学预后有关，认为CO和NO可能在新生儿缺血缺氧性脑病的发病机制中担任重要角色［3-4］。

本研究目的在于观察心肺复苏术后患者血清NO 和CO含量的变化特点以及颅痛定对患者血清NO和CO含量有无影响，了解颅痛定对心肺复苏患者再灌注过程有无保护作用及其可能的机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 本科于2011年1月～2012年12月收治心肺复苏术后患者共35例，随机分为治疗组（20例）和对照组（15例）。治疗组男9例，女11例，平均年龄62.2±15.8 岁，其中复苏时间≤15min者11例，定义为早期治疗组；复苏时间＞15分钟者9例，定义为晚期治疗组。对照组男11例，女4例，平均年龄67.2±13.3岁，其中复苏时间≤15min者8例，定义为早期对照组；复苏时间＞15分钟者7例，定义为晚期对照组。

1.2 治疗方法 两组患者心肺复苏术成功后均立即采取脑复苏常规治疗措施，包括呼吸支持、循环支持、体温管理、控制抽搐、控制血糖、维持灌注、维持酸碱和水盐平衡等，以及针对原发病的各种治疗措施。其中治疗组在心肺复苏后即经胃管鼻饲颅痛定60 mg（四川康福来药业集团有限公司），tid×72小时。

1.3 标本收集 心肺复苏成功后分别于第6h、24h、48h、72h抽取患者外周静脉全血，离心处理（1000r/min）10 min，取标本上清液，-20℃液氮罐保存。

1.4 NO测定 NO在体内代谢转化为亚硝酸盐（NO2-）和硝酸盐（NO3-），血清NO2-与NO3-浓度之和（NO2-+ NO3-）代表体内NO水平。血清（NO2-+ NO3-）含量测定，按照试剂盒（货号：A012，南京建成公司）说明书操作测定样品吸光度值（OD550），按照公式：NO含量（μmol/L）=标准品浓度（100μmol/L）×样品测试前稀释倍数×（测定OD值-空白OD值）÷（标准OD值-空白OD值）计算血清中NO含量，单位以μmol/L（血清）表示。

1.5 CO测定 按照内源性一氧化碳（CO）测试盒说明书（货号：A101-3，南京建成公司）测定目的样品和对照样品568nm与 581nm 的吸光度，即A568和A581，采用说明书对应的计算公式计算血清中CO含量，并以μmol/L（血清）表示。

1.6 统计学处理 数据用均数±标准差表示，用SPSS18.0软件进行分析。由于数据不符合正态分布，所以组间比较采用Kruskal-Wallis检验，P＜0.05为差异有显著性。用各变量的摘要制作多线线图观察心肺复苏后血清NO和CO浓度变化的规律以及治疗组和对照组之间的相互关系。

2 结果

2.1 早期组NO含量的变化 心肺复苏后6h血清NO浓度上升，24h达高峰；随后下降，48h降至低谷，然后再次上升。颅通定显示出对NO产生的抑制作用，治疗组和对照组之间NO浓度变化曲线几乎呈平行状态（见图1）。治疗组和对照组之间相同时间点的数据比较显示，6h和24h差别无显著性（P＞0.05），而48h和72h则差别有显著性（P＜0.05）。（见表1）

图1 早期组（治疗组和对照组）NO含量的变化及比较

表1 早期组（治疗组和对照组）不同时间血清NO浓度（μmol/L）

2.2 晚期组NO含量的变化 对照组心肺复苏后6h血清NO浓度上升，24h达高峰；随后又下降，48h降至低谷，然后再次上升，与早期对照组图形相似。治疗组NO浓度变化方向与对照组几乎相反，颅通定虽然表现出了对NO生成的抑制作用，但与对照组没有平行关系。治疗组和对照组之间相同时间点的数据比较，无论是6h、24h、48h还是72h差别均无显著性（P＞0.05）。（见表2）

图2 晚期组（治疗组和对照组）NO含量的变化及其比较

表2 晚期组（治疗组和对照组）不同时间血清NO浓度（μmol/L）

2.3 早期组CO含量的变化 对照组CO浓度在心肺复苏后6h下降，24h降至低谷，48h略有上升，然后再次下降。治疗组CO浓度在心肺复苏后6h开始上升，随后急剧下降，48h降至低谷，然后再次上升。整个变化过程治疗组与对照组几乎呈相反方向（见图3）。治疗组和对照组之间相同时间点的数据比较显示，无论是6h、24h、48h还是72h，CO浓度比较差别均无显著性（P＞0.05）。（见表3）

图3 早期组（治疗组和对照组）CO含量的变化及其比较

表3 早期组（治疗组和对照组）不同时间血清CO浓度（μmol/L）

2.4 晚期组CO含量的变化 对照组CO浓度在心肺复苏后6h急剧下降，24h降到低谷，随后一直上升。治疗组表现出对CO生成的抑制作用，从复苏后6h到72h几乎呈直线下降趋势（见图4）。但治疗组和对照组之间各时间点的数据比较显示，无论是6h、24h、48h还是72h，CO浓度差别均无显著性（P＞0.05）。（见表4）

图4 早期组（治疗组和对照组）CO含量的变化及其比较

表4 晚期组（治疗组和对照组）不同时间血清CO浓度（μmol/L）

3 讨论

研究结果显示，心肺复苏术后病人外周血NO浓度于再灌注期间逐渐升高，24h达到一个高峰，48h降到一个低谷，然后再次上升并且达到更高浓度。无论是早期组还是晚期组病人都符合这一规律，两组NO浓度曲线形态非常近似。说明成人血清NO浓度在心肺复苏后的脑缺血再灌注阶段总体呈增高趋势，这与其他学者在动物脑缺血实验和新生儿缺血缺氧性脑病中所观察到的结果基本一致［1］［4］。

NO已被证实在脑缺血再灌注损伤中扮演重要角色，它的增高在早期有一定的积极意义。由内皮型细胞一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）催化形成的NO能激活胞浆中的鸟苷酸环化酶（guanylate cyclase，GC）使cGMP水平升高，导致血管平滑肌舒张、增加脑皮质血流量、降低神经元胞浆中Ca2+浓度，可防止血小板和白细胞的聚集与粘附，对神经细胞起保护作用，对恢复梗塞边缘血流、增加氧供、恢复神经细胞功能都有帮助［5］。

然而NO在缺血性脑损伤中的作用具有“双重性”［6］。首先，体内NO由NOS催化 L-精氨酸（L-Arginine，L-Arg）而生成，NO的结构中有不配对电子，所以也是一种自由基；内皮细胞中产生的NO还可与超氧阴离子（O2-）结合，形成过氧亚硝酸阴离子（ONOO-）［7］，ONOO-可能通过使反式作用因子发生硝化、氧化反应，破坏其结构和功能，影响了其与顺式作用元件的结合，抑制NOSⅢmRNA转录；ONOO-能够与线粒体DNA（mtDNA）发生反应使之生成减少，抑制线粒体电子链的传递及内呼吸过程使ATP生成减少和迅速耗竭，抑制线粒体锌超氧化物歧化酶（ZnSOD）的活性，使O2-的生成进一步增加。ONOO-通过以上机制破坏线粒体的结构和功能产生负面效应。其次，催化NO产生的NOS可分为cNOS（原生型）和iNOS（诱生型），cNOS 又可分为eNOS（内皮细胞型）和nNOS（神经细胞型）。eNOS定位于内皮细胞，产生的NO对脑缺血起保护作用，nNOS定位于神经细胞，产生的NO在缺血性损害中起作用。iNOS定位于多种细胞，生理状况下表达，其激活不依赖Ca2+，被激活后产生大量NO，对迟发性神经元死亡起重要作用。在脑缺血再灌注的不同阶段有不同类型的NOS在发挥着作用。脑缺血极早期（＜2h），由eNOS产生的NO通过促进血管扩张、抑制血小板聚集、及白细胞粘附来增加半暗区脑血流，从而发挥脑保护作用。脑缺血早期（2-6h），NO主要来源于nNOS，对缺血早期脑损害发挥重要作用。脑缺血晚期（＞6h），iNOS催化产生的NO对迟发性进行性神经元损伤起主要作用。

前期学者们对动物的研究已经证实脑缺血再灌注后无论是脑组织还是血清中NO含量都会逐渐增加［1］，并且这种增加与NOS活性的增高是同步的［8］。这就说明NO含量的增加来自于NOS活性的上调。由于对迟发性进行性神经元损伤起主要作用的NO主要来自于iNOS的催化作用，所以脑保护药物作用的重点应该是抑制iNOS活性、进而减少脑缺血晚期多种细胞产生的NO。已知L-THP在动物脑动脉内皮细胞缺氧时可抑制NOS ⅢmRNA表达的上调，在复氧时又可抑制NOSⅢmRNA表达的下调，从而调节NO的生成［9］。这一研究结果从细胞分子水平层面证实了L-THP抑制脑缺血再灌注引起的外周血NO浓度升高的机制。

我们的研究首次证实颅通定可抑制成人患者心肺复苏术后血清NO浓度的升高，这种抑制作用在再灌注48h和72h组表现出显著性差异。根据以前诸多专家们的研究结果推测，颅通定的这种作用机制可能是抑制了脑缺血再灌注后的iNOS活性。研究结果还显示晚期组血清NO浓度的变化与早期组的规律基本一致，L-THP也表现出了对NO产生的抑制作用，但这种作用并没有体现出显著性差异。目前，还没有足够的实验资料解释这种现象。笔者认为，晚期组在临床上多为院外心跳骤停患者，脑缺血时间相对较长，而脑缺血超过6-7分钟，神经系统就会发生不可逆性损害。虽然后期复苏成功，但其病理生理改变必然有一定的特殊性。而且，颅通定对NOSⅢmRNA的调节作用也因缺氧和复氧的时间阶段有所不同［9］。所以，对于这种现象还有待今后做进一步深入研究。

此外，动物实验中颅通定对内皮细胞的NO和NOS ⅢmRNA的调控作用表现出一定的剂量依赖性［9］。而我们的研究所使用的颅通定剂量是说明书推荐的镇静基础剂量，对于脑保护作用来说是否偏小不得而知。而且，目前市场上已无颅通定注射液供应，我们在研究中使用颅通定片剂鼻饲，而心肺复苏刚刚成功的病人胃肠道也处于再灌注之中，吸收能力极其有限，颅通定的血药浓度很难保证，势必影响研究结果。未进行颅通定的血药浓度监测为本研究的缺陷之一。

CO与NO一样也是一种重要的细胞信使分子。内源性CO来源于血红素氧合酶（HO）对血红素的分解，血红素被分解为螯合铁、CO 和胆绿素。另一重要来源是生物有机分子的氧化，特别是生物膜的脂质过氧化。HO共包括3种同工酶，分别为HO-1 、HO-2 和HO-3，它们是不同的基因产物。HO-1为诱生型，又称为热休克蛋白- 32 （HSP-32）［10］，广泛分布于全身组织的微粒体中，但脑组织中含量很少。在各种应激因子的作用下，HO-1均能被诱导产生，因而被认为是目前所知体内受影响因素最多的酶。HO-2称为结构型，主要存在于血管内皮、平滑肌细胞和神经之内，是生理状态下的主要存在形式［11］。而HO-3，则是新近发现的另一种结构型同工酶，存在于脑、肝、脾等诸多组织中。到目前为止，在血管系统中尚未发现有HO-3 表达［12］。在氧化应激和炎症刺激时HO-2 和HO-3可首先发挥作用，随后HO-1迅速上调并强烈表达，以对抗进一步的损伤。

CO 到达靶分子后，与胞质中的可溶性鸟苷酸环化酶（solube guanylate cyclase，SGC）结合，使环化酶构象发生改变而被激活（因此CO被认为是SGC 的激动剂），并催化GTP生成cGMP，再由cGMP激活蛋白激酶或磷酸二酯酶，从而表现出各种生理效应，如舒张血管平滑肌，参与循环系统的调节等。这是CO发挥生理效应的主要机制。

HO在脑缺血再灌注损伤中也表现出“双重作用”。CO的积极作用有抗炎症、抗凋亡、调节血管张力（在脑缺血缺氧早期，CO可使脑血管扩张）、调控白细胞的黏附和血小板的聚集、发挥神经递质作用等，在一定程度上改善脑组织的缺血缺氧状态。

同时CO在脑缺血再灌注损伤中的负面作用研究也很多。新生大鼠脑缺血再灌注时脑组织内HO-1（诱导性）高度表达，内源性CO水平显著升高，其升高的程度与病情严重程度密切相关，提示HO-CO-cGMP系统可能在脑缺血再灌注损伤中发挥重要作用［13］。同时，已有临床研究说明CO可能作为一种内源性介质参与新生儿HIE的发病过程［14］。甚至还有学者认为内源性一氧化碳浓度检测可作为早期评估HIE预后的参考指标［15］。而颅通定可通过抑制HO-1活性使一氧化碳（CO）和cGMP水平下降，减少神经元丢失，提高存活神经元数目，减轻脑缺血/再灌注损伤［16］。

我们的研究结果显示，早期组病人再灌注期间外周血CO浓度逐渐下降，晚期组病人则表现为外周血CO浓度下降后又重新上升，但无论是早期组还是晚期组病人中颅通定均未表现出对CO浓度明显的调节作用，这与既往其他学者的动物研究结果有所不同［2］，可能有待今后设计更严密的研究方法来解释这种现象。可以肯定的是，本研究采用的标本是外周静脉血，对于脑缺血再灌注的观察存在着一定的缺陷，因为心肺复苏成功后，全身各个器官系统都存在着再灌注损伤，外周静脉血无法真实地反映脑血流中CO的含量，除非在心肺复苏时行颈静脉逆行穿刺置管收集单纯的脑血流标本，但这种方法操作难度大，对于抢救生命的心肺复苏病人不太适用。另外，各种动物研究说明颅通定对抗脑缺血再灌注损伤作用的能力与颅通定的剂量有很大关系［9，17-18］，对内源性CO的作用有无剂量依赖性尚有待进一步研究。总之，作为首次针对心肺复苏病人所做的颅通定脑保护作用研究有一定的临床意义，但由于影响因素复杂，可控性无法与动物实验相比，且课题设计本身存在某些缺陷，其结果只能为下一步研究提供参考。

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Influence of L-terahydropalmatine on NO and CO Concentration in Patients' Serum with Cardiopulmonary Resuscitation

Chen Qi-guo， He Cai-xia， He Qi
（ICU， the Fourth Hospital of Changsha， Changsha 410006， China）

Objective To observe the changes of serum NO and CO in patients with cardiopulmonary resuscitated （CPR）successfully and the effects of rotundine （L-THP） to these changes. Method The patients were randomly divided into treatment group （20 cases） and control group （15 cases）， then further divided the treatment group and control group into the early and late group from cardiac arrest to start recovery time bounded in 15 minutes. Extracted patients’ blood of peripheral venous on 6 h，24 h， 48 h， 72 h after the cardiopulmonary resuscitated successfully， determined serum NO content by the method of nitrate reduction， determined CO content by the method of visible spectrophotometer. Results Serum NO concentration increased on 6h after cardiopulmonary resuscitated （CPR） successfully， reached a peak on 24 h； Then dropped to trough in 48h and then rose again. Rotundine （L-THP） showed inhibition on NO， the curves of the content of NO change in the early treatment group and early control group were almost in a parallel state， the NO content of two groups had no significant difference on 6 h， 24 h， but showed a significant difference on 48 h， 72 h. The NO concentration change direction of the late treatment group and control group was almost the opposite， rotundine（ L-THP） would also show the inhibition of NO generation， but had no parallel relation with the control group. In any period the difference of serum NO content in late treatment group and control group were not significant. The CO concentration of early control group dropped after 6h of the recovery， subsequent dropped sharply to trough after 24 h ， then increased slightly after 48 h， and then fell again. The CO concentration curve of early treatment group and control group was almost in the opposite direction. In the Late， the CO concentration of the control group in the recovery fell sharply after 6h， dropped to the trough after 24h， then has been rising. Rotundine showed the inhibition of CO generation. The trend of treatment group from 6 h to 72h after recovery was almost straight down. But whether the CO concentration of early or late group had no significant difference at all time points. Consiusion Rotundine（L-THP） may play a role of anti cerebral ischemia reperfusion injury through the regulation of NO content in the body of patients in cardiopulmonary resuscitation （CPR）， and the effect in patients with early recovery （≦15 min） showed obviously. But the effect of rotundine （ L-THP） to CO content in the patients’body with cardiopulmonary resuscitation （CPR） is not obvious.

L-tetrahydropalmatine； Nitric oxide； Carbon monoxide； Cardio pulmonary Resuscitation； Cerebral ischemia reperfusion

R711.5

A

1673-016X（2016）01-0014-05

2015-08-20

湖南省卫生厅资助项目（湘卫科教发【2007】7号）

陈齐国，E-mail: 2689154488@qq.com