5-氮杂-2’-脱氧胞苷对Molt-4细胞RASSF10基因启动子甲基化状态的影响研究

谢 景，孟 欣，王燕燕，何小飞，郑 珊

（1.贵阳市护理职业学院医学类基础部，贵阳 550003；2.贵阳市金阳医院，贵阳 550081）

5-氮杂-2’-脱氧胞苷对Molt-4细胞RASSF10基因启动子甲基化状态的影响研究

谢 景1，孟 欣2，王燕燕1，何小飞1，郑 珊1

（1.贵阳市护理职业学院医学类基础部，贵阳 550003；2.贵阳市金阳医院，贵阳 550081）

目的：Molt-4细胞应用5-氮杂-2’-脱氧胞苷进行处理，并观察期对Molt-4细胞RASSF10基因启动子甲基化状态的影响。方法：于体外进行Molt-4细胞培养，并采用不同浓度5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理。然后采用MTT法检测性别增殖抑制率，同时采用RT-PCR法检测RASSF10 mRNA表达情况。采用COBRA检测RASSF10甲基化水平；Westernblot法检测RASSF10蛋白表达情况。结果：经检测发现，采用一定浓度5-氮杂-2’-脱氧胞苷作用于Molt-4细胞后，细胞增殖抑制率明显升高；且表现为剂量依赖性和时间性。然对照组Molt-4细胞R中未检测出RASSF10 mRNA、蛋白表达情况。然经5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理后，RASSF10基因出现部分甲基化。结论：临床应用5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理Molt-4细胞，其可经对RASSF10基因去甲基化来恢复RASSF10表达，最终达到抑制Molt-4细胞增殖效果。

5-氮杂-2’-脱氧胞苷；Molt-4细胞；甲基化

DNA甲基化异常是一种表观遗传学现象，同时也是细胞癌变过程中的早期及频发事件，此外，其还是一个可逆性的生物学过程［1］。因此，临床可将甲基化特异基因来作为诊断及治疗肿瘤疾病的分子标志。并对特异基因实施甲基化处理后可达到治疗肿瘤效果。RASSF10为RASSF家族成员，据相关报道称［2］，RASSF10启动子甲基化频繁出现于前列腺癌及甲状腺癌等肿瘤中。本次为研究5-氮杂-2’-脱氧胞苷对Molt-4细胞RASSF10基因启动子甲基化状态的影响，特进行以下研究。

1 资料与方法

1 一般资料 试剂：5-氮杂-2’-脱氧胞苷由Sigma公司生产；RPMI1640培养基由Hyclone公司提供；RNA提取及RT-PCR试剂盒（TAKARA 公司）。基因组DNA提取试剂盒（Qiagen公司）、DNA甲基化试剂盒（Millipore公司）、DNAmarker及引物（上海生工公司）、RASSF10多克隆抗体（Abgent公司）。

1.2 方法 细胞培养：将Molt-4细胞放置于含有10%的胎牛血清RPMI1640培养液中，然后置于温度37℃、5%CO2孵箱中进行培养。采用倒置显微镜对其生长情况进行观察。

四唑盐比色法（MTT）：选取对数生长期细胞用于检测，然后将药物浓度调整为1×105/mL并对细胞进行处理，接种于96孔板上［3］。然后使用5-氮杂-2’-脱氧胞苷对其进行作用24h、48h、72h后取出，然后于每孔中加入5g/LMTT150ul，并放置于温度为37℃孵箱中继续培养，时间为4h［4］。然后取出进行离心处理，并取上清液，再加入DMSO150il，震荡混匀后于酶标仪570nm下进行测定其吸光度（A），并计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）=（A对照-A实验）/A对照×100.0%［5］。

逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）：采用5-氮杂-2’-脱氧胞苷作用72h后，Trizol提取总RNA，并使用紫外分光光度计对RNA纯度进行检测［6］。

免疫印迹法（Western blot）：收集经5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理72 h后Molt-4细胞的总蛋白，按100ug/孔上样［7］。10% SDS-PAGE 电泳后转膜至NC膜上［8］。5%脱脂牛奶封闭1 h，封I抗RASSF10（1∶500）4℃过夜［9］。次日TBST、TBS洗膜。封HRP标记的羊抗兔II抗（1∶2000）45 min，同法洗膜［10］。ECL化学发光，将膜置于暗盒中，暗室内胶片曝光，冲洗胶片［11］。

亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法（COBRA）：取对照组、10umol/L经5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理72 h后的Molt-4细胞［12］。

1.3 统计学方法 数据采用SPSS20.0软件统计与分析，采用t、卡方检验。结果以P＜0.05表示具有统计学意义。

2 结果

2.1 5-氮杂-2’-脱氧胞苷对Molt-4细胞增殖影响

Molt-4细胞经不同浓度5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理后，其增殖抑制率明显低于药物处理组（P＜0.05）；且不同浓度组间比较（P＜0.05）。由此而说明5-氮杂-2’-脱氧胞苷对Molt-4细胞增殖有一定抑制作用，且表现为剂量依赖性及时间性。

2.2 5-氮杂-2’-脱氧胞苷对RASSF10 蛋白表达

影响 对照组细胞中并无RASSF10表达；经5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理后，各组RASSF10蛋白表达量出现明显上调，且与5-氮杂-2’-脱氧胞苷浓度有关（P＜0.05）。比较对照组与5-氮杂-2’-脱氧胞苷各浓度组细胞的内参GAPDH表达量（P＞0.05）。见表1。

表1 5-氮杂-2’-脱氧胞苷对RASSF10 蛋白表达影响

2.3 5-氮杂-2’-脱氧胞苷对RASSF10 mRNA表达影响 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示，RASSF10 mRNA于对照组Molt-4细胞中不表达，但经2.5 μmol/L、5.0 μmol/L、10.0 μmol/L5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理后，其重新表达，且其表达强度与5-氮杂-2’-脱氧胞苷浓度呈正比（P＜0.05）。RASSF10相对表达量采用ARASSF10/ AGAPDH表示。如表2。

表2 5-氮杂-2’-脱氧胞苷对RASSF10 mRNA表达影响

2.3 5-氮杂-2’-脱氧胞苷对RASSF10基因启动子甲基化状态影响 经检测发现，采用Molt-4细胞被处理前后，其RASSF10基因启动子区域甲基化状态如图4。对照组消化的DNA条带较为明显，因此而说明对照组存在启动子甲基化现象。采用PCR扩增后，含有TaqI识别位点可被TaqI消化水解，并出现水解条带。但经10 μmol/L5-氮杂-2’-脱氧胞苷作用72 h后则可见清晰且未被TaqI消化水解的条带，消化水解的DNA条带不明显；因此而说明启动子存在甲基化与非甲基化共存的情况，且原有甲基化RASSF10基因启动子区域可大部分被去甲基化。

3 讨论

本次研究发现，不同浓度所处理后的Molt-4细胞增殖抑制程度存在明显差异性，因此说明5-氮杂-2’-脱氧胞苷可有效抑制白血病细胞增殖、生长。本次研究为降低5-氮杂-2’-脱氧胞苷自身对本次研究细胞所产生的毒性作用而导致研究结果受到影响，所以选择浓度较小的5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理Molt-4细胞。对照组Molt-4细胞中RASSF10基因启动子是被甲基化修饰的，而RASSF10 mRNA、蛋白在Molt-4细胞中不表达。但经采用510 umol/L-氮杂-2’-脱氧胞苷处理后，RASSF10基因启动子部分发生去甲基化作用，其RASSF10 mRNA及蛋白重新出现表达。因此而说明抑癌基因RASSF10失表达的主要机制为RASSF10基因启动子的高度甲基化修饰。5-氮杂-2’-脱氧胞苷主要是通过抑癌基因RASS F10基因发生去甲基化，最终使得RASSF10重新恢复表达，并发挥其抗白血病作用。

综上所述，5-氮杂-2’-脱氧胞苷可降低Molt-4细胞RASSF10基因的甲基化程度，同时可诱导其重新表达，进而有效抑制Molt-4细胞增殖。

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5-aza-2'-deoxycytidine Impact on Molt-4 cells RASSF10 gene promoter methylation status

Xie Jing1， Meng Xin2， Wang Yan-yan1， He Xiao-fei1， Zheng Shan1
（1.Guiyang City Career Academy Department of Medicine Basic Nursing ，Guiyang 550003， China； 2.Department of Nnternal Medicine， Jinyang Hospital of Guiyang City， Guiyang 550081， China）

Objective Discussion and Analysis of 5-aza-2’-deoxycytidine impact on Molt-4 cells RASSF10 gene promoter methylation status. Methods Molt-4 cells were cultured in vitro and the use of different concentrations of 5-aza-2’-deoxycytidine treatment. Then using the MTT assay gender proliferation inhibition rate， while using RT-PCR assay RASSF10 mRNA expression. COBRA detection RASSF10 using methylation level； Westernblot RASSF10 protein expression was detected. Results After testing found that the use of certain concentration 5-aza-2’-deoxycytidine acting on the Molt-4 cells，cell proliferation was significantly increased ； and showed a dose-dependent and time-sensitive. However， Molt-4 cells in the control group was not detected in the R RASSF10 mRNA， protein expression. However， by 5-aza-2’-deoxycytidine treatment after， RASSF10 appear partially methylated genes. Conclusion Clinical application of 5-aza-2’-deoxycytidine treated Molt-4 cells， which may be of RASSF10 gene demethylation to restore RASSF10 expression， and ultimately achieve the effect of inhibiting the proliferation of Molt-4 cells.

5-aza-2’-deoxycytidine； Molt-4 cells； Methylation

R256.1

A

1673-016X（2016）01-0008-03

2015-02-02

谢景，E-mail: dftttr@163.com