一测多评法同时测定酸枣仁的多个成分含量

张秋红于姗姗岳路路

（1济南市食品药品检验检测中心，山东 济南250102；2山东中医药大学，250355）

一测多评法同时测定酸枣仁的多个成分含量

张秋红1于姗姗1岳路路2

（1济南市食品药品检验检测中心，山东 济南250102；2山东中医药大学，250355）

目的：建立一测多评法测定酸枣仁中斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、白桦脂酸含量的方法，并验证该方法在酸枣仁中应用的准确性和科学性。方法：以白桦脂酸为指标，采用超高效液相色谱法（UPLC）计算斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B与白桦脂酸的相对校正因子，进而用该校正因子计算其他3种成分含量；同时外标法测定酸枣仁中4种成分含量，比较“一测多评”法所得结果与外标法测得结果的相似度。结果：一测多评法和外标法测得的酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素含量的计算值和实测值之间的夹角余弦值分别为0.999 72，0.999 71和0.998 36，两者相似度较好，没有显著性差异。结论：UPLC可以简便、快速地测出酸枣仁4个成分含量，一测多评法适用于酸枣仁中4种有效成分的含量测定，相对校正因子可信。

一测多评；超高效液相色谱法；酸枣仁；斯皮诺素；酸枣仁皂苷A；酸枣仁皂苷B；白桦脂酸；含量测定

《中国药典》2010年版中收载酸枣仁是鼠李科植物酸枣（Ziziphus jujuba Mill.var.Spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou）的干燥成熟种子。其味甘、酸，性平。归肝、胆、心经。养心安神，用于体虚多汗，津伤口渴，惊悸多梦，虚烦不眠［1-2］。常被用作镇静、安眠、益肝类药品和相关保健食品的药材之一。皂苷类、黄酮类、生物碱类等是酸枣仁的有效成分；而酸枣仁中皂苷类和黄酮类化合物是其镇静催眠的主要有效成分；酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B和斯皮诺素为酸枣仁的专属性活性成分［3-4］；近年来，有文献报道白桦脂酸为酸枣仁中重要活性成分之一［5-6］；且《中国药典》2010年版用两种方法测定酸枣仁皂苷A和斯皮诺素含量效率较低。现有不少文献建立了同时测定酸枣仁中多个成分的方法［7-8］。本研究以酸枣仁中主要成分酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B和斯皮诺素作为测定目标，以白桦脂酸为内标物，建立灵敏、简便的同时测定酸枣仁中酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素和白桦脂酸的超高效液相色谱法（UPLC），以期为酸枣仁的含量测定及质量控制提供依据［9-10］。

一测多评就是用价格便宜或制备简单的对照品来实现对多个不易得到对照品的成分的同步测定。本研究采用一测多评法，以白桦脂酸对照品为内标物，同时测定酸枣仁中斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B 4种成分的含量，并与外标法实测值进行比较，为酸枣仁的含量测定提供一种可供选择的新方法。

1 仪器、试剂

高速万能粉碎机（FW80，天津市泰斯特仪器有限公司）；数显恒温水浴锅（HH-4，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；电子天平（BSA224S-CW，赛多利斯科学仪器北京有限公司）；Agilent 1200SL型高分离度快速液相色谱仪；Waters ACQUITY型超高效液相色谱仪。

斯皮诺素（批号：110869-201102，中国食品药品检定研究院，含量以90.7%计）；酸枣仁皂苷 A（批号：110734-200510，中国食品药品检定研究院，供薄层扫描含量测定用）；酸枣仁皂苷 B（批号：110814-200607，中国食品药品检定研究院，供薄层扫描含量测定用）；白桦脂酸（批号：111802-201001，中国食品药品检定研究院，供鉴别用）；乙腈、甲醇、磷酸为色谱纯；实验用水为纯净水；酸枣仁（经济南市食品药品检验检测中心鉴定为正品）。

2 实验方法

2.1 色谱条件

Agilent Eclipse Plus C18色谱柱（50 mm × 4.6 mm，1.8 μm），Wates ACQUITY UPLC○RBEH C18色谱柱（50 mm × 2.1 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈（A）；0.03%磷酸水溶液（B）；梯度洗脱：0～3.5 min，14.5% ～ 14.5%A；3.5～ 4 min，14.5% ～37%A；4～ 6 min，37%～ 37%A；6～ 6.5 min，37%～ 83%A；6.5～ 8 min，83%～90%A；8～8.5 min，90% ～100%A；8.5～ 9 min，100% ～14.5%A；9～ 12 min，14.5% ～ 14.5%A；流速1.0 mL/min；检测波长204 nm，柱温30℃，进样量1 μL。

2.2 对照品溶液的制备

各取斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B和白桦脂酸对照品适量，精密称定为18.72，10.22，11.06，13.57 mg，置于同一个50 mL容量瓶中，加甲醇定容制成含斯皮诺素 374.4 μg/mL，酸枣仁皂苷A 204.4 μg/mL，酸枣仁皂苷B 221.2 μg/mL，白桦脂酸271.4 μg/mL的混合对照品溶液50 mL。

2.3 供试品溶液的制备

取本品粉末（过四号筛）约 l g，精密称定，置索氏提取器中，加石油醚（60～ 90℃）热回流4小时，弃去石油醚液，药渣挥去溶剂，转移至锥形瓶中，加入70%乙醇20 mL，加热回流2小时，滤过，滤渣用70%乙醇5 mL洗涤，合并洗液与滤液，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察精密吸取上述酸枣仁混合对照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL分别置5 mL容量瓶中加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为标准系列溶液，按上述色谱条件项下进样，记录峰面积，以各对照品浓度对峰面积积分值进行回归处理，得斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B和白桦脂酸的标准曲线见表 1。

表1 线性回归方程和线性范围

2.4.2 精密度试验精密吸取同一供试品溶液1 μL连续进样6次记录4个组分的峰面积。斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、白桦脂酸峰面积的 RSD分别为 0.492%，0.04%，0.779%，1.39%，表明精密度良好。

2.4.3 稳定性试验精密吸取同一供试品溶液1 μL分别于 1，2，3，4 d进样2次测定峰面积积分值，斯皮诺素、酸枣仁皂苷 A、酸枣仁皂苷 B、白桦脂酸稳定性的 RSD分别为0.389%，1.27%，4.31%，4.22%，表明该试验在4天内稳定。

2.4.4 重复性试验取同一批酸枣仁粉末，按“供试品溶液制备”项下制备供试品溶液6份，进样测定，记录峰面积。斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、白桦脂酸含量的RSD分别为1.23%，0.105%，2.53%，1.35%，表明方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验取酸枣仁样品约1 g，精密称定9份，分别加入一定量对照品，按照“供试品溶液制备”项下制备高、中、低3个浓度的供试品溶液，进样测定，记录峰面积。斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、白桦脂酸加样回收率的平均RSD分别为97.32%，93.67%，91.28%，95.37%。

2.4.6 样品含量测定取酸枣仁样品，按“供试品溶液制备”项下制备供试品溶液，进样测定，记录含量，每批样品平行制备2份，平行进样2次以4个结果的平均值作为测定值，结果见表 2。

表2 酸枣仁中4种成分的含量测定结果　（%）

2.5 一测多评

2.5.1 方法原理成分的浓度在一定的范围内与检测器响应成正比。多指标质量评价以该药某一典型组分（对照品易得到）为内标，通过该组分与其他组分之间的相对校正因子计算其他组分的含量［11］。

设样品中含i个组分，

Wi/Ai=fi（i=1..2...k...m），

Ai——组分峰面积；Wi——组分浓度。

假设组分k是内标，则组分k与其他组分m之间的相对校正因子：

fkm=fk/fm=WkAm/WmAk①。

由①得出定量计算公式：

Wm=WkAm/fkmAk②。

Ak——内标物峰面积；Wk——内标物浓度。Am——其他组分m峰面积；Wm——其他组分m浓度。

2.5.2 相对校正因子经调查得知，酸枣仁有效成分4个对照品以白桦脂酸最为便宜，选为内标物，依据公式②分别计算酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素对白桦脂酸的校正因子［12］。

2.5.3 色谱柱及高效液相色谱仪考察取“2.4.1”项下稀释至原来0.3倍混合对照溶液，分别进样5次，每次1 μL，考察2种高效液相色谱仪和2种色谱柱Eclipse Plus C18（50 mm×4.6 mm，1.8 μm），ACQUITYUPLC○RBEHC18（50mm×2.1mm，1.7μm）。结果见表3［13］。

2.5.4 色谱峰专属性根据相对保留时间进行待测组分色谱峰的定位，已知内标峰的保留时间，根据相对保留时间以及色谱峰的峰形，就可以正确判断出目标峰的位置。结果见表4［14］。

2.5.5 样品测定精密称取6批酸枣仁药材粉末，制备供试品溶液。分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各 1 μL注入高效液相色谱仪测定。分别采用外标法和一测多评法计算酸枣仁中斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、白桦脂酸含量，结果见表 5。

2.5.6 比较研究一测多评方法与常规法用夹角余弦值方法比较常规的外标法实测含量与一测多评计算的含量，证实一测多评方法用于多指标成分含量测定的可靠性。

3 实验结果

色谱柱及高效液相色谱仪考察结果，酸枣仁中组分保留时间及相对保留时间如表3。

根据公式②计算得到的酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素对白桦脂酸的校正因子结果如表4。

用外标法和一测多评法计算酸枣仁中斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B含量比较如表5。

表3 酸枣仁中组分保留时间及其相对保留时间差

表4 酸枣仁中其他3组分对白桦脂酸的相对校正因子

表5 酸枣仁中有效成分的一测多评法与外标法比较 （μg/mL）

本试验采用一测多评法和外标法测得的斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B的计算值和实测值之间的夹角余弦值分别为0.999 72，0.999 71 和0.998 36，表明两种方法测得含量没有显著性差异。

4 分析与结论

本研究用UPLC同时测定酸枣仁中的4种有效活性成分，使用单波长紫外检测器，分离度好、出峰快，方便简单、节省时间，可用于批量测定酸枣仁含量，为酸枣仁质量控制提供依据。专属性和校正因子问题是一测多评的重点。本实验酸枣仁4个成分在不同柱子和仪器上出峰时间有所变化，但其相对保留时间变化不大，所以利用相对保留时间能较好地解决专属性问题。

本研究考察了不同的色谱柱和液相色谱系统对白桦脂酸和斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B之间相对校正因子的影响；比较了外标法实测组分的绝对含量与一测多评法推算含量，以评价一测多评方法的准确性和科学性，进而证明实验中得到的校正因子具有较高的可信度；通过计算可知一测多评法与外标法测到的含量之间没有显著性差异，一测多评法可以在对照品缺省的情况下实现定量测定的要求。目前许多文献对不同产地的酸枣仁药材质量做出研究评价，酸枣仁有效成分得到越来越清晰、简便的分析，有待进一步细致研究。

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Simultaneous Determination of 4 Components in Ziziphi Spinosae Semen by Multi-components Assay with a Single Marker

Zhang Qiuhong1，Yu Shanshan1，Yue Lulu2（1 Jinan Experimental Center for Drug and Food，Shandong Jinan 250102，China；2 Shandong University of Traditional Chinese Medicine，250355）

Objective：To develop a multi-components assay with a single marker（QAMS）for determination of contents of spinosin，jujuboside A，jujuboside B and betulinic acid in Ziziphi Spinosae Semen，and verify its accuracy and scientificalness.Methods：Using betulinic acid as an index，the relative correlation factors（RCFs）of spinosin，jujuboside A and jujuboside B were calculated by UPLC and used for the calculation of the contents of the three components.Results：The cosine coefficient of contents of jujuboside A，jujuboside B and spinosin calculated by QAMS and by external standard method were 0.999 72，0.999 71 and 0.998 36 respectively，indicating good similarities with no significance.Conclusion：The four components in Ziziphi Spinosae Semen may be determined by UPLC simply and rapidly.QAMS may be used for the content determination of four components in Ziziphi Spinosae Semen，of which the RCFs are reliable.

Quantitive Analysise of Multi-components with a Single-maker（QAMS）；UPLC；Ziziphi Spinosae Semon；Spinosin；Jujuboside A；Jujuboside B；Betulinic Acid；Content Determination

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.09.004

2016-04-02）

张秋红，女，硕士，副主任药师。主要从事中药质量控制与研究。E-mail：zhangqh9886@163.com

于姗姗，女，硕士，主管药师。主要从事中药质量控制与研究。通讯作者E-mail：yssyb@126.com