高效液相色谱法测定栅藻中5种类胡萝卜素的含量

张彩凌*， 牛春芳， 葛兴信， 武献春

(新奥科技发展有限公司，煤基低碳能源国家重点实验室，河北廊坊 065001)

类胡萝卜素是一种重要的天然色素，它不仅是一种很好的食品添加剂,而且广泛应用于化妆品、保健品等。同时类胡萝卜素在人体内具有多种生物学功能，可对一些疾病起到预防和治疗作用[1]。目前，对类胡萝卜素的分析多采用高效液相色谱法(HPLC)。而HPLC法用于类胡萝卜素分离分析时最常用C18柱，流动相常用甲醇、异丙醇、乙腈、水，并配以一些溶剂如正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷，采用梯度洗脱[2 - 6]。但是C18柱对于结构相似的类胡萝卜素及其异构体的分离仍然是一项挑战[7]，最为典型的情况是玉米黄质和叶黄素两者互为异构体，分离起来比较困难。1992年，Craft[8]首次应用C30柱分离类胡萝卜素标准品和血清中的类胡萝卜素。随后人们尝试用C30柱来优化类胡萝卜素的分离[9]。尤其是在分离叶黄素和玉米黄质这两种结构非常相似的化合物上，C30柱显示出了明显的优势。目前还未见报道采用C30柱HPLC法分离检测栅藻中各种色素含量的报道。

微藻是生产类胡萝卜素的最佳来源，栅藻是一种常见的淡水微藻，含有丰富的类胡萝卜。本文以该藻为研究对象，用C30-HPLC法对其中的虾青素、叶黄素、玉米黄质、角黄素和β-胡萝卜素5种类胡萝卜素的含量进行测定，此方法具有分离效果好、多组分同时分析的特点。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200高效液相色谱仪(美国,Agilent公司)，配紫外检测器；3-15高速离心机(Sigma)，超声波清洗仪(南京垒君达超声电子设备有限公司)。

标准品：虾青素(纯度96.0%)、玉米黄质(纯度85%)、角黄素(纯度≥98%)购于Toronto Research Chemicals Inc)；叶黄素(纯度≥90%)购于Seebio Biotech,Inc；β-胡萝卜素标品(纯度≥93%)购于Sigma，各标准品-18 ℃避光储存于。称取适量5种色素的标准品用二氯甲烷和丙酮的混合液溶解(超声波促进溶解)，加入适量的2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)，定容于25 mL棕色瓶中，充氮气并于-18 ℃冰箱避光保存。二甲基亚砜、丙酮、乙腈、二氯甲烷均为分析纯，甲醇和甲基叔丁基醚均为色谱纯。实验用水为蒸馏水。

1.2 提取与皂化

准确称取50 mg藻粉，加入4 mL 二甲基亚砜(DMSO)，放入超声波清洗仪中于20 ℃超声15 min，离心，取上清液，剩余藻渣加入4 mL提取液二氯甲烷∶甲醇混合液(体积比 25∶75)，放入超声波清洗仪中20 ℃超声15 min，离心，取上清液；重复此步骤直至上清液和藻渣变白。合并上清液，加入1/6体积的0.107 mol/L NaOH-甲醇溶液，混匀，充氮气，在4 ℃冰箱中黑暗冷皂化12 h。于上述皂化液中加入3～5 mL石油醚，震荡均匀后加入与皂化液等体积的蒸馏水，静置分层后，吸取上层液体；剩余液体继续加入石油醚提取，直至色素全部抽提完全。合并上层液体，氮气吹干，然后用5 mL提取液定容，经0.22 μm针筒式有机滤膜过滤，滤液待测。

1.3 高效液相色谱法测定条件

色谱柱：YMC-carotenoid C30柱(250×4.6 mm,5 μm，日本YMC公司)；流动相：A为甲醇∶甲基叔丁基醚∶水混合液(体积比81∶15∶4)，流动相B为甲醇∶甲基叔丁基醚∶水混合液(体积比 7∶90∶3)。洗脱程序：0～55.6 min,100%～44.4%A；流速：1.0 mL/min；紫外检测器检测波长：450 nm；进样量：10 μL；柱温：20 ℃。外标法定量。

2 结果与讨论

2.1 稳定性

由于类胡萝卜素是由多个异戊二烯单元构成，其中所含的多个双键导致该类化合物具有极大的不稳定性，在光照下易被破坏，很容易被空气中的氧或过氧化物氧化，所以混标应该避光低温保存。样品前处理过程中应尽快完成且尽量避免强光，控制操作温度，利用超声波提取时需控制提取温度在20 ℃以下，皂化在低温条件下进行并且不能时间太长，充氮气。

2.2 提取及皂化方法的考察

天然虾青素是以酯的形式存在,一般采用提取皂化的方法进行测定。孙伟红[10]等人采用二氯甲烷、甲醇提取经碱皂化的微藻中的色素，但因5种色素溶解度的差异性，所以不适合采用2种溶剂提取。本实验采用DMSO超声破壁的方法预提取栅藻中的色素，再采用混合溶剂提取，使栅藻中的5种色素达到充分的溶出提取。而对于β-胡萝卜素则同时采用了直接提取测定和提取皂化测定的方法，并且对于两种方法的结果进行了比较，结果表明皂化不会影响β-胡萝卜素含量测定，所以最终对样品采用提取皂化的方法处理。对于样品中的角黄素进行了提取率实验，测得提取率为91%。

2.3 色谱分离与定性

选择C30柱,柱温20 ℃，比较了乙腈∶甲醇∶甲基叔丁基醚体系做流动相、乙腈∶水∶甲基叔丁基醚/磷酸体系做流动相、甲醇∶水∶甲基叔丁基醚体系做流动相进行分离分析，发现乙腈∶甲醇∶甲基叔丁基醚体系、乙腈∶水∶甲基叔丁基醚∶磷酸体系做流动相玉米黄质与叶黄素无法很好分离，因此本实验选取甲醇∶水∶甲基叔丁基醚体系做流动相进行洗脱。借鉴Sander[11]等应用的C30柱分离类胡萝卜素的方法，对洗脱程序进行优化，缩短了样品分析的时间。图1(A)为虾青素、叶黄素、玉米黄质、角黄素和β-胡萝卜素混合标样的液相色谱图，图1(B)为栅藻样品皂化提取液的色谱图。从图中可见，在本实验选定的色谱条件下，5种色素得到较好的分离。对5种色素的分离进行了分离度和理论塔板数的计算，结果表明5种色素的分离度都在2.0以上，理论塔板数都在6 000以上，能够满足测定要求。

2.4 线性关系与检出限

配制5种色素的系列浓度混合标准溶液并进行测定，以质量浓度(x，μg/mL)为横坐标,以峰面积(y)为纵坐标绘制标准工作曲线；以3倍信噪比(S/N)测得各组分的检出限。虾青素、叶黄素、玉米黄质、角黄素和β-胡萝卜素在一定浓度范围内呈良好线性关系。线性回归方程、线性范围、相关系数及检出限如表1。

表1 方法的线性方程、线性范围、相关系数及检出限

2.5 回收率与精密度试验

为验证方法的可靠性，进行了回收率和精密度(RSD)试验。每一加标水平重复测定5次，结果如表2所示。由表2可见，添加回收率高，准确度和精密度都能满足类胡萝卜素含量测定要求，适用于栅藻中类胡萝卜的含量测定。

表2 方法的加标回收率(n=5)

3 结论

本文建立了栅藻中5种类胡萝卜素提取皂化的方法,使得一次性同时分离检测5种色素的含量成为可能，该处理方法节省时间，准确可靠。C30-高效液相色谱-紫外检测法检测5种类胡萝卜素，分离度、理论塔板数均可以满足分离分析要求。该方法准确、可靠，操作简单，可同时定性定量分析栅藻中5种类胡萝卜素的含量。