QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法测定酵母抽提物中9种黄色合成色素

粟有志， 马晓雯， 孟 茹*， 李 芳， 李艳美， 雷红琴

(1.伊犁出入境检验检疫局综合技术服务中心，新疆伊宁 835000；2.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐 830052)

黄色合成色素多数属于偶氮类染料，主要用于纺织、制鞋、造纸等工业领域，具有致畸、致癌性、致突变等毒性作用。柠檬黄、日落黄、喹啉黄等属于食品添加剂，可在特定食品中添加，但大部分黄色合成色素不允许用于食品。酵母抽提物是一种以酵母为原料经自溶、精制等工艺而制得的营养丰富的天然调味料，在调味品、方便面等食品行业中具有广泛的用途[1]。为防止以非法添加黄色合成色素的方式伪造或以次充好酵母抽提物，建立酵母抽提物中黄色合成色素的检测方法十分必要。

目前，国内外对黄色合成色素的检测主要有酶联免疫法[2]、分光光度法[3]、毛细管电泳法[4]、液相色谱法[5 - 8]和液相色谱-质谱联用法[9 - 12]，常见于豆制品、饮料、化妆品等样品，而酵母抽提物中黄色合成色素的检测方法未见报道。目前，文献报道黄色色素的前处理方法主要为固相萃取法，而本文采用简便、快捷的QuEChERS方法[13]前处理样品，结合高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)分析，建立了酵母抽提物中9种黄色合成色素的测定方法。该方法与文献报道方法相比，简化了前处理步骤，其灵敏度和检出限能够满足合成色素的残留限量要求及检测确证要求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260-6460A液相色谱-串联质谱仪(美国，Agilent公司)，配有电喷雾离子源(ESI)；Sigma3-18K型台式冷冻离心机(德国，Sigma公司)；T18基本型均质器和MS3型涡旋振荡器(德国，IKA)；N-EVAP-112型水浴氮吹仪(美国，Organomation公司)；Strata-X-AW固相萃取小柱(60 mg/3mL，美国Phenomenex公司)；Oasis WAX固相萃取小柱(规格均为60 mg/3mL，美国Waters公司)。

日落黄、酸性橙Ⅱ、橙黄G、酸性黄11、酸性黄36均购自Dr.Ehrenstorfer公司；酸性黄151购自Sigma公司；酸性橙56、酸性黄73、酸性黄79购自TCI公司，所有标准品纯度均大于98%。标准储备溶液：分别准确称取各标准品1 g(精确至0.01 mg)，用水溶解并定容至1 L，配成质量浓度为1 000 mg/L的单一标准储备液，于4 ℃冰箱中储存。混合标准溶液：用水稀释配制混合标准溶液，各色素的最终浓度为：酸性黄151为1.0 mg/L，酸性黄36、酸性黄73、酸性橙Ⅱ为1.5 mg/L，酸性黄79、酸性橙56为15 mg/L，橙黄G为25.0 mg/L，日落黄为50 mg/L，酸性黄11为150 mg/L。乙腈、甲醇、丙酮、乙醇、甲酸、正己烷均为色谱纯；N-丙基乙二胺(PSA)。C18粉、磺酸化聚苯乙烯/二乙烯苯(PCX)、聚苯乙烯/二乙烯苯(PEP)、酸性氧化铝(ALA)、氨基(NH2)、石墨化炭黑(GCB)7种吸附剂，均购自Agela公司。实验用水为Milli-Q超纯水。

1.2 样品前处理

称取1 g样品(精确至0.01 g)于50 mL具塞离心管，加入10 mL乙腈-甲醇(5∶5，V/V)，10 000 r/min均质1 min，超声30 min，10 000 r/min离心5 min，取上层清液7 mL于15 mL具塞离心管，加入乙腈饱和的正己烷5 mL涡旋30 s，静置5 min，弃去正己烷层。加入吸附剂C18和PEP粉各0.1 g，摇匀，10 000 r/min离心5 min，取上清液5 mL于10 mL试管中，40 ℃水浴氮吹至干，用1 mL乙腈-水(1∶9,V/V)复溶。将溶液转移至1.5 mL离心管中，15 000 r/min离心10 min，上清液供HPLC-MS/MS测定。

1.3 HPLC-MS/MS条件

色谱柱：Zorbax Eclipse Plus C18柱(100×3.0 mm,1.8 μm)；柱温：30 ℃；进样量：10.0 μL；流动相：A相为乙腈，B相为10 mmol/L NH4Ac溶液，流速：0.3 mL/min；梯度洗脱程序如下：0～3.5 min，10%～50%A；3.5～8.5 min，50%～70%A；8.5～9.0 min，70%～90%A；9.0～10.5 min，90%A；10.51～14.5 min，10%A。电离模式：电喷雾负离子源模式(ESI-)；多重反应监测(MRM)；干燥气温度：350 ℃；干燥气流量：9.0 L/min；鞘气温度：300 ℃；鞘气流速：11.0 L/min，毛细管电压:3.5 kV；监测离子对、碰撞能量、碎裂电压等参数见表1。

表1 9种黄色合成色素的质谱分析参数

*quantitative ion.

2 结果与讨论

2.1 仪器条件的优化

本文所检测的9种黄色合成色素均为含有磺酸基的酸性化合物。在不接色谱柱的条件下对9种色素单一标准溶液进行母离子全扫描，确定准分子离子峰。利用Optimizer软件对9种色素的子离子、碎裂电压、碰撞能量等参数进行优化，获得最佳的仪器条件。参照欧盟指令657/2002/EEC决议中有关规定，本文选择离子丰度最高、本底干扰最小的两个离子对作为定性离子对，其中信号较大的离子对作为定量离子。通过比较不同无机相与有机相的组合比较分析发现，以乙腈-10 mmol/L NH4Ac溶液为流动相时，9种色素的离子化效益较好。通过优化的1.3中的梯度洗脱程序，9种目标色素均可获得较好的分离度和响应信号。

2.2 提取溶剂的选择

9种黄色合成色素极性均较强，易溶于水。实验比较了极性溶剂丙酮、水、乙醇、乙腈、甲醇、乙腈-甲醇(5∶5,V/V)、丙酮-甲醇(5∶5,V/V)对9种色素的提取效果。结果表明：水和甲醇提取时，酵母抽提物完全溶于提取剂，样品易形成糊状，给后续净化带来困难；乙腈、丙酮、乙醇、丙酮-甲醇(5∶5,V/V)提取时，部分色素的回收率达不到检测要求；乙腈-甲醇(5∶5,V/V)提取时，9种色素提取的回收率为84%～101%，可满足分析的要求。不同提取溶剂对酵母抽提物样品中9种色素的提取效果见图1。

2.3 净化条件的选择

本文比较了PSA、C18、PCX、PEP、NH2、ALA、GCB 7种吸附剂对样品的净化效果。结果表明：PCX、PSA、GCB、NH2、ALA净化，部分色素的回收率达不到检测要求，而采用C18和PEP，9种色素的回收率均可满足检测要求。7种吸附剂对9种合成色素的净化效果见图2。

同时本文还考察了Oasis WAX和Strata-X-AW两款阴离子固相萃取小柱对9种色素的净化效果。结果表明，两款固相萃取小柱的回收率均可满足检测要求，但净化后的9种色素的基质效应与C18和PEP共同净化时无明显差别。故本文最终选择C18和PEP两种吸附剂共同净化样品。空白酵母抽提物样品和添加9种黄色合成色素的空白样品，经提取和净化后的MRM色谱图见图3。

2.4 方法的线性关系、检出限和定量限

实验发现，样品基质对9种黄色合成色素均有一定的抑制作用，本文采用基质匹配标准曲线以消除样品基质效应。准确称取1 g样品(精确到0.01 g)按照1.2和1.3前处理及仪器分析，当各色素定性定量离子信噪比均小于3时，样品确定为空白基质；空白基质按照1.2前处理，最后分别用1、1/2、1/5、1/10、1/20、1/50倍的混合标准溶液各1 mL溶解残渣，配成基质匹配标准溶液。以峰面积(y)对合成色素的质量浓度(x)作线性回归，绘制标准曲线，9种色素在酵母抽提物基质中的相关系数(r2)均大于0.994。方法的检出限(S/N>3)为0.01～0.09 mg/kg，定量限(S/N>10)为0.02～3.00 mg/kg。9种黄色合成色素的线性方程、检出限和定量限详见表2。

2.5 方法的准确度和精密度

选择酵母抽提物空白样品，以1、2、10 倍LOQ为加标水平进行回收率实验。按照1.2方法和1.3条件进行前处理和测定，每个水平重复6次。回收率和相对标准偏差见表3。从表3可以看出，9种合成色素的回收率在75.5%～115.1%范围，相对标准偏差(RSD)为4.7%～17.6%，表明该方法的准确度和精密度均较好。

表2 9种黄色合成色素的线性方程、检出限和定量限

表3 9种黄色合成色素的添加回收率和相对标准偏差(n=6)

2.6 样品测定

利用本方法对实验室送检的20种酵母抽提物进行检测，均未发现目标分析物。

3 结论

本文建立了以甲醇-乙腈(5∶5,V/V)为提取剂，经PEP和C18净化，高效液相色谱-串联质谱仪测定酵母抽提物中日落黄、橙黄G、酸性黄73、酸性橙Ⅱ、酸性橙56、酸性黄11、酸性黄36、酸性黄79和酸性黄151共计9种黄色合成色素的检测方法。该方法操作简便、精密度好、回收率高，可为酵母抽提物中此类物质的风险监控提供技术支持。