酶法与高效液相色谱法测定糖化血红蛋白的结果比对分析

黄艳萍　王星

摘要：目的 评估高效液相色谱法（HPLC）与酶化学法测定糖化血红蛋白的结果相关性和偏倚。方法 使用全自动糖化血红蛋白仪D-10采用高效液相色谱法和东芝TBA-120全自动生化分析仪以酶化学法分别测定40例EDTA-K2抗凝血液样本糖化血红蛋白，对结果进行分析比较；计算线性相关系数，直线回归方程和预期偏倚。结果 全自动糖化血红蛋白仪D-10高效液相色谱法的测定均值为7.78%，TBA-120全自动生化分析仪酶化学法测定均值为7.74%，线性回归方程为y=1.0349x-0.3111，r2=0.9923，无显著性差异（P>0.05），糖化血红蛋白可接受偏倚大于预期偏倚可信区间上限。结论 酶化学法与高效液相色谱法结果相关性良好，可满足临床要求。

关键词：高效液相色谱法；酶化学法；糖化血红蛋白

糖化血红蛋白Alc（HbAlc）是反映血液中葡萄糖水平的一个中长期指标，国际上通常将其做为糖尿病血糖控制的"金指标"[1]。目前我室采用高效液相色谱法和酶化学法，为给临床提供可靠地检测结果，比较两种检测方法测定HbAlc的差异，探讨其可比性，现参照美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）标准的EP9-A2文件[2]，对其进行比较分析。

1资料与方法

1.1一般资料 收集我院住院患者糖化血红蛋白标本40例，均为EDTA-K2抗凝全血。

1.2仪器和试剂 高效液相色谱法：全自动糖化血红蛋白仪D-10及配套试剂标准品；酶化学法：日本东芝TBA-120全自动生化分析仪，试剂和标准品为九强公司提供的HbAlc测定试剂；质控品为美国Bio-Rad公司生产，批号为33860.

1.3方法

1.3.1精密度实验 根据NCCLS EP5-A文件的要求进行精密度实验。采用美国Bio-Rad公司的中值质控和高值质控。批内不精密度实验：同一天将2份质控品连续定20次；批间不精密度实验：将2份质控品测定1次/d，连续测定20d。

1.3.2方法学评价 以全自动糖化血红蛋白仪D-10高效液相色谱法为比较方法，将标本放置在样本架上直接自动进样测定；另一份标本以东芝TBA-120全自动生化分析仪酶化学法为试验方法，将九强HbAlc试剂中的a1和a2以7：3混合，作为前处理液，将标本混匀，吸取20μL溶于250μL的前处理液中，使红细胞溶解释放血红蛋白，将溶解液放进测试孔位进行测定，反应类型为一点法。依据EP9-A2文件的要求，8个/d标本在不同的分析批测定，将标本按照1～8和8～1的顺序做两遍，进行相关性分析和偏倚评估。

1.4数据处理

1.4.1离群点检验 将每一个标本经两种方法的前后两个测定值一一对应，依次求出差值，并计算出所有标本中的平均差值，以4倍的平均差值为判断限值。若仅有一个离群点，将之剔除，继续下述分析；如离群点超过2个，应分析原因，然后再另用標本补做。

1.4.2绘制散点图和偏倚图 以全自动糖化血红蛋白仪D-10高效液相色谱法的测定结果为X，东芝TBA-120全自动生化分析仪酶化学法测定值为Y，绘制散点图。可以直观的观察异常值、线性程度、偏倚。

1.4.3计算线性回归方程 y=a+bx和r2。

1.4.4临床可接受性判断 将b和a以及Xc（HbAlc）医学决定水平值[3]代入SE=|（b-1）Xc+a|，以SE是否小于或等于1/2CLIA'88规定的允许误差（TEα）判断是否可接受。

1.5统计学处理 结果以均数±标准差（x±s）表示，显著性检验用t检验，使用SPSS20.0进行统计学分析。

2结果

2.1精密度评 按照临床实验室管理要求批内不精密度低于1/4 TEα，批间不精密度低于1/3TEα；经计算求得，糖化血红蛋白两种检测方法的批内CV均小于1/4 TEα（6.67%），批间CV均小于1/3TEα（6.67%），说明试验方法和比较方法的精密度符合要求，比对实验数据可靠，见表1。

2.2散点图和偏倚图 将40例标本所得的数据绘制成散点图和偏倚图。散点图以东芝TBA-120全自动生化分析仪酶化学法两次测定的均值为Y轴，比较方法以全自动糖化血红蛋白仪D-10高效液相色谱法两次测定的均值为X轴，见图1。偏倚图以两种方法两次测定均值的差值为Y轴，以高效液相色谱法两次测定的均值为X轴，以直线X=0为水平中线，见图2。

图1 D-10与TBA-120测定HbAlc的均值散点图

图2 D-10与TBA-120测定HbAlc的差值偏倚图

2.3离群点检验 经查方法内，方法间均无离群点。

2.4线性回归计算 y=1.0349x-0.3111，r2=0.9923，r2>0.95，说明两种方法相关性良好，见图3。

图3 D-10与TBA-120测定HbAlc的线性回归图

2.5高效液相色谱法（HPLC）与酶化学法测定结果 HPLC与酶法测定HbAlc无显著性差异（P>0.05），结果见表2

2.6偏倚评估 把HbAlc医学决定水平值代入SE=|（b-1）Xc+a|，见表3。从表3可以看出HbAlc可接受偏倚大于预期偏倚可信区间上限，SE≦1/2CLIA'88规定的允许误差（TEα），说明两方法结果相当，可被临床接受。

3讨论

HbAlc可反映近2～3个月的血糖平均水平，国际上将其作为糖尿病血糖控制的金标准，对预示微小血管病变，评估糖尿病并发症的发生和发展有着重要的临床意义。目前临床实验室用于检测HbAlc的方法很多，主要有离子交换层析法、电泳法、胶乳免疫法等，其中离子交换层析法主要有高效液相色谱法和微柱法[4]，美国临床化学协会（AACC）糖化血红蛋白标准化分会和国际临床化学协会（IFCC）糖化血红蛋白标准化工作组建议，以高效液相色谱法作为检测HbAlc的金标准[5]。使其它方法参照此法实现标准化。酶化学法测定HbAlc在普通自动生化仪上广泛应用，测定前要手工前处理，测定结果受人为因素影响较大，离子交换高效液相色谱法是利用离子交换的材料固定相来分离离子型化合物的方法，是糖化血红蛋白自动分析仪的常用方法，该法快速、精密、准确。

本次实验将酶化学法和高效液相色谱法按照EP9-A2文件进行比对，结果显示两者相关性良好，r2=0.9923，r2>0.95，且均有较好的精密度，两法的测定结果相当，无显著性差异，酶化学法的测定结果可接受，可满足临床需要。

通过对两种检测方法间HbAlc检测结果的比对，判断两种方法的测定结果无明显差异，可为HbAlc在不同实验室间实现结果互认提供参考依据，使测定结果更可靠。

参考文献：

[1]李兵.糖化血红蛋白检验接轨国际标准[N].健康报，2004：12：21.

[2]丛玉隆，王前.实用临床实验室管理学[M].人民卫生出版社，2011，1，5：77-103.

[3]李池慧，黄续炜，吴翡斐，等.两种检测系统糖化血红蛋白的比对分析[J].国际检验医学杂志，2014，1，35（1）：90-93.

[4]阮绍均.高压液相层析法与酶法检验糖化血红蛋白的比较[J].实验与检验医学，2009，27（5）：465-466.

[5]肖弘，王敏，李小盛，等.离子交换高效液相层析法与酶化学法测定糖化血红蛋白的比对分析[J].检验医学，2010，25（11）：888-889.

编辑/孙杰