基于EPMA的背角无齿蚌贝壳中元素分布的初步研究

陈修报,姜 涛,刘洪波,苏彦平,杨 健



基于EPMA的背角无齿蚌贝壳中元素分布的初步研究

陈修报,姜 涛,刘洪波,苏彦平,杨 健*

(中国水产科学研究院淡水渔业研究中心,中国水产科学研究院长江中下游渔业生态环境评价和资源养护重点实验室,江苏 无锡 214081)

应用电子显微探针元素分析技术,对背角无齿蚌(Anodonta woodiana)的贝壳(棱柱层和珍珠层)进行了19种元素(Ag、Al、Au、Ca、Co、Cu、Fe、Hf、Mg、Mn、Mo、Na、Re、Se、Sn、Sr、Tl、V、Zn)分布特征的初步研究.元素面分布分析和定量线分析结果均直观而明显地表明:贝壳中Ca含量最高,Hf、Re、Mn、Al、Co、Fe、Sr、Cu和Na的含量较低,而Au、Mg、Tl、Zn、Sn、Ag、V、Mo和Se的含量甚少.Mn在珍珠层的分布高于棱柱层,壳顶区域的珍珠层的含量(0.087±0.045)%显著高于棱柱层(0.030±0.025)%(<0.05),腹缘区域的珍珠层的含量(0.072±0.055)%亦显著高于棱柱层(0.044±0.025)%(<0.05),而其余元素在贝壳中均匀分布.

背角无齿蚌；贝壳；元素微化学；EPMA；生物监测

双壳贝类(包括软组织和贝壳)是监测水环境中元素(包含重金属)污染动态的理想指示生物[1-5].贝壳的主要结构为钙质的棱柱层和珍珠层[6].与软组织相比,贝壳(特别是棱柱层和珍珠层)具有易保存,与元素结合稳定(不发生分解或释放),甚至生物体死亡后仍能记录历史环境等优点[3,7].因此,基于贝壳的元素污染监测越来越受到重视[8-9].

背角无齿蚌()隶属于软体动物门、瓣鳃纲、蚌科,在亚洲、欧洲和北美洲等世界范围内广泛分布[10-12].不仅具有育珠,食用和净化水质的作用[12],其贝壳还具备药用(珍珠母)价值[10].此外,作为“淡水贝类观察”研究体系(Freshwater Mussel Watch)的专用指示生物[13-14],该蚌软组织已被广泛用于监测国内、外水环境的农药[15-16]、有机锡[13]以及重金属[14,17-19]的污染状况,而且贝壳也被成功用于监测和评价重金属(Mn、Fe、Cu、Zn、Cd)的污染水平[2].

贝壳棱柱层和珍珠层对元素如Cu[7]、Mn[20]的富集特征差异明显.然而,迄今利用贝壳监测水环境元素污染动态,几乎都是通过消解整个贝壳之后应用原子吸收光谱法(AAS)[2]、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)[21]或电感耦合等离子质谱仪(ICP-MS)[9,22]等测定,完全丢失了不同壳层元素分布特征的重要信息[3].此外,激光剥蚀电感耦合等离子体质谱仪(LA-ICP- MS)也被尝试用于在保留贝壳原有结构的情况下分析元素分布特征[3],然而该技术也存在着对测定壳层表面剥蚀损伤较重,结果无法图像化的局限.

电子探针显微分析仪(EPMA)具有无损伤测定、灵敏度高、图像分析能力强、对样本量需求少(1个样本即可客观地阐明元素分布特征)等优点[23],完全能够避免上述局限.基于EPMA,古丸明等[24]分析了不同盐度水体中河蚬(sp.)贝壳中Sr和Ca的分布,发现Sr/Ca比值与盐度总体呈正相关;Shirai等[23]通过北极蛤()的1片贝壳成功阐释了不同壳层对Sr、Mg和S的吸收机制及分布特征.本研究拟利用EPMA首次探索淡水蚌类背角无齿蚌贝壳(棱柱层和珍珠层)中19种元素(Ag、Al、Au、Ca、Co、Cu、Fe、Hf、Mg、Mn、Mo、Na、Re、Se、Sn、Sr、Tl、V、Zn)的分布特征,以期为正在开展的“淡水贝类观察”研究体系精准筛选更为灵敏的指示物(贝壳壳层)提供支撑.

1 材料与方法

1.1 材料处理

从2008年在太湖采集的背角无齿蚌中选择1个贝壳无畸形、无损伤的代表性样本,3龄,壳长13.3cm,壳宽5.4cm,壳高8.1cm.解剖去除软组织,将贝壳用Milli-Q水清洗干净,自然晾干.用切割机(Accutom-50型,丹麦Struers公司)沿壳顶至腹缘的垂直方向切割出3mm宽的片段(图1).环氧树脂(Epofix,丹麦Struers公司)包埋固定之后,1200目砂纸对横截面(图1)进行精磨.为了满足仪器分析的规格需求,将该片段分割为长度均匀的5等份,最后用磨抛机(Rotopol-35型,丹麦Struers公司)对用于分析的横截面进行抛光.元素测定之前,样本用Milli-Q水超声波水浴洗净.

1.2 分析方法

为了进行元素电子探针显微分析,样本在真空蒸着装置中镀碳膜(JEE-420,日本JEOL公司).因为贝壳壳顶包含着贝类整个生活阶段的全部信息[25],因此用EPMA(JXA-8100,日本JEOL公司)首先进行该部分的元素的X-射线强度图像化(X-ray Intensity Maps)分析(简称面分布分析),以初步判别元素在不同壳层的分布特征.此时EPMA使用的电子束电流为5×10-7A,记录时间为0.1s,像素为7μm×7μm,电子束电流聚焦直径为5 μm.对于分布表现出明显差异的元素,则进一步扫描壳顶区域和能够灵敏反映元素富集的新形成的腹缘区域[3](图1),做直线定量测定(简称定量线分析).此时EPMA使用的加速电压为15kV,电子束流为2.0×10-8A,束斑直径为5μm,每点驻留时间为15s,样品点分析间隔为10μm.

1.3 统计分析

本研究的统计分析使用美国IBM公司的SPSS 16.0软件.元素浓度均为干重含量,以平均值±标准差表示.差异的显著水平判定使用Mann-Whitney测验进行.

2 结果与讨论

背角无齿蚌贝壳由表及里依次为角质层、方解石结构的棱柱层和霰石结构的珍珠层(图2).面分布分析显示背角无齿蚌贝壳(壳顶区域)中Ca含量最高(元素含量约占38%),Hf、Re、Mn、Al、Co、Fe、Sr、Cu和Na的含量较低(元素含量约占0.7%~0.2%),而Au、Mg、Tl、Zn、Sn、Ag、V、Mo和Se的含量甚少(元素含量约占0.1%~0),(图3).Mn在珍珠层的分布表现出高于棱柱层的趋势,其余元素在棱柱层和珍珠层之间分布均匀(图3).定量线分析表明,Mn在壳顶区域的珍珠层中的含量(0.087±0.045)%显著高于棱柱层(0.030±0.025)% (<0.05,图4),并且其在腹缘区域的珍珠层中的含量(0.072±0.055)%亦显著高于棱柱层(0.044±0.025)% (<0.05,图4).

背角无齿蚌贝壳由外套膜边缘上皮细胞和结缔组织细胞分泌形成[26].外套膜细胞在分泌形成厚度约100μm的角质层后,以此为模板,分泌形成多边形棱柱体,按由外侧至内侧,由背侧至腹侧的方式堆砌成棱柱层,最后分泌形成珍珠层,并随着生长时间的推移而逐步加厚[26].因此,贝壳的生物矿化是由细胞控制的,并受到水体理化特征等环境因素的影响[27].研究发现贝壳富集元素有主动吸收(生物矿化)和被动吸附(从周围水环境中简单吸附)两种途径[9],而主动吸收是元素积累的主要方式[3].

贝壳主要由方解石(棱柱层)和霰石(珍珠层)构成,CaCO3是贝壳的最主要成分,并含有少量的Mn、Ni、Mo、Mg等元素[22,28].本研究的面分布分析结果,从横截面的角度进一步证实了背角无齿蚌贝壳的元素含量特征.与传统的将贝壳整体消解、测定相比,波兰Licheńskie Lake中背角无齿蚌贝壳的Mn、Fe、Zn和Cu含量分别为200, 70, 35和14μg/g, Licheński Channel中背角无齿蚌贝壳的Mn、Fe、Zn和Cu含量分别为180,50,42和11μg/g,除了Zn含量偏高之外,这两水域背角无齿蚌贝壳元素含量的高低顺序与本研究一致[2].同为无齿蚌属的贝壳中Ca、Mn、Mo、Zn、Cu、V、Co和Tl含量分别为383631, 289, 104, 46, 11, 3, 1和0μg/g[22],元素含量高低顺序总体和背角无齿蚌差别较大,这提示贝壳元素组成在种间具有特殊性.

迄今,对于元素在贝壳中分布特征的研究非常有限.Rončević等[21]认为元素在贝壳中的分布与壳层结构有关,由方解石构成的棱柱层容易吸收比Ca离子半径小的元素(如Fe、Mn、Cu、Zn),而霰石构成的珍珠层更容易吸收比Ca离子半径大的元素(如Na).然而,面分布分析结果显示Ag、Al、Au、Ca、Co、Cu、Fe、Hf、Mg、Mo、Na、Re、Se、Sn、Sr、Tl、V和Zn这18种元素在背角无齿蚌的棱柱层和珍珠层中呈均匀分布,并未表现出显著的壳层分布差异(图2).相反,虽然Mn离子半径小于Ca,背角无齿蚌珍珠层却富集了更多的Mn(图2,3).因此,背角无齿蚌贝壳中元素的分布特征不支持Rončević等[21]观点.另有研究表明元素在贝壳中的分布与水环境如盐度[24]、元素含量[3,7,29]密切相关.河蚬贝壳珍珠层中Sr含量和盐度呈正相关,根据Sr含量可以反演其生活履历[24].翡翠贻贝()贝壳(特别是新形成部分)中重金属如Mn、Cd、Cu、Pb,会随着水体中相应元素含量上升而显著增加[3].本研究发现背角无齿蚌贝壳珍珠层Mn含量显著高于棱柱层,这与淡水珍珠贝()贝壳Mn分布特征一致[20],而不同于淡水贝类贝壳Mn在珍珠层和棱柱层均匀分布[25].太湖水体未受到明显的重金属污染, Mn平均含量为48.3μg/L,但其含量变异系数为36%(变化范围为26.3~88.3μg/L)[30],提示背角无齿蚌贝壳的珍珠层比棱柱层能够更为灵敏地反映出水环境中元素(如Mn)的动态.研究表明应用热处理(加热到350~400℃)等方法能够分离出贝壳的珍珠层[31-32],因此,利用珍珠层监测渔业生态环境重金属污染具有可行性.值得注意的是,双壳贝类珍珠层与其分泌的产物珍珠具有相近的组分与构造[28],除此之外,珍珠还有插珠技术成熟、取样方便、分析前处理相对简单等优点,今后应该可以作为贝壳珍珠层的理想“替代品”,更简便、快速地用于上述重金属污染的监测.相关进一步的研究需要得到高度重视.

3 结论

3.1 在未受明显重金属污染的自然水体中,背角无齿蚌贝壳中Ca为最主要成分,Hf、Re、Mn、Al、Co、Fe、Sr、Cu和Na的含量较低,Au、Mg、Tl、Zn、Sn、Ag、V、Mo和Se的含量甚少;Mn在珍珠层的分布显著高于棱柱层,Ag、Al、Au、Ca、Co、Cu、Fe、Hf、Mg、Mo、Na、Re、Se、Sn、Sr、Tl、V和Zn在贝壳中均匀分布.

3.2 污染水体中的背角无齿蚌贝壳元素(特别是有毒有害重金属Pb、Cd、Cr、Hg、As等)分布差异性还需进一步监测验证.然而,即使在元素背景含量较低的水体中,其珍珠层已显示出比棱柱层更为灵敏地反映Mn等元素的变化动态.因此,在今后的“淡水贝类观察”研究体系中建议选用珍珠层(包括其分泌产物珍珠)作为水环境重金属(至少是Mn)污染监测和评价的指示物.

[1] 贺广凯.黄渤海沿岸经济贝类体中重金属残留量水平 [J]. 中国环境科学, 1996,16(2):96-100.

[2] Królak E, Zdanowski B. The bioaccumulation of heavy metals by the mussels(Lea, 1834) and(Pall.) in the heated Konin Lakes [J]. Archives of Polish Fisheries, 2001,9:229-237.

[3] Bellotto V R, Miekeley N. Trace metals in mussel shells and corresponding soft tissue samples: a validation experiment for the use ofshells in pollution monitoring [J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2007,389:769-776.

[4] Makarenko T V, Baychorov V M. Heavy metals content in the shells and soft tissues of mollusks of the water bodies of Gomel and adjacent territories [J]. Hydrobiological Journal, 2014,2:33-40.

[5] 孙元敏,马志远,黄海萍.我国海岛潮间带贝类体中重金属含量及其评价 [J]. 中国环境科学, 2015,35(2):574-578.

[6] Paula S M, Silveira M. Studies on molluscan shells: contributions from microscopic and analytical methods [J]. Micron, 2009, 40:669-690.

[7] Andrello A C, Lopes F, Galvao T D. Mussel shell evaluation as bioindicator for heavy metals [C]//Deppman A, Krug C, Zahn G S, Lubian J, Added N, Timoteo V S (Ed), XXXII Brazilian Workshop on Nuclear Physics, AIP Conference Proceedings, 2010:110-113.

[8] Shoults-Wilson W A, Seymour L, Unrine J M, et al. Improving data resolution and statistical rigor in the analysis of bivalve shells [J]. Environmental Science: Processes Impacts, 2014,16:247-255.

[9] Bolotov I N, Pokrovsky O S, Auda Y, et al. Trace element composition of freshwater pearl musselsspp. across Eurasia: testing the effect of species and geographic location [J]. Chemical Geology, 2015,402:125-139.

[10] 刘月英,张文珍,王跃先,等.淡水软体动物 [M]. 科学出版社, 1979.

[11] Watters G T. A synthesis and review of the expanding range of the Asian freshwater mussel(Lea, 1834) (Bivalvia: Unionidae) [J]. Veliger, 1997,40:152-156.

[12] Chen X, Liu H, Su Y, et al. Morphological development and growth of the freshwater musselfrom early juvenile to adult [J]. Invertebrate Reproduction and Development, 2015,59(3):131-140.

[13] Yang J, Harino H, Liu H, et al. Monitoring the organotin contamination in the Taihu Lake of China by bivalve mussel[J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 2008,81:164-168.

[14] 陈修报,苏彦平,刘洪波,等.移殖“标准化”背角无齿蚌监测五里湖重金属污染 [J]. 中国环境科学, 2014,34(1):225-231.

[15] Uno S, Shiraishi H, Hatakeyama S, et al. Accumulative characteristics of pesticide residues in organs of bivalves (and) under natural conditions [J]. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 2001,40:35-47.

[16] Bian X, Liu H, Gan J, et al. HCH and DDT residues in bivalvesfrom the Taihu Lake, China [J]. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 2009,56:67-76.

[17] 杨 健,王 慧,朱宏宇,等.背角无齿蚌()在五里湖中的重金属富集 [J]. 长江流域资源与环境, 2005,14(3): 362-366.

[18] Liu H, Yang J, Gan J. Trace element accumulation in bivalve musselsfrom Taihu Lake, China [J]. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 2010, 59:593-601.

[19] Chen X, Yang J, Liu H, et al. Element concentrations in a unionid mussel () at different life stages [J]. Journal of the Faculty of Agriculture Kyushu University, 2012,57:139-144.

[20] Nyström J, Lindh U, Dunca E, et al. A study ofshells from the River Pauliströmsån, S. Sweden [J]. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B - Beam Interactions with Materials and Atoms, 1995,104:612-618.

[21] Rončević S, Svedružić L P, Smetiško J, et al. ICP-AES analysis of metal content in shell of musselfrom Croatian coastal waters [J]. International Journal of Environmental Analytical Chemistry, 2010,90(8):620-632.

[22] Ravera O, Cenci R, Beone G M, et al. Trace element concentrations in freshwater mussels and macrophytes as related to those in their environment [J]. Journal of Limnology, 2003, 62:61-70.

[23] Shirai K, Schöne B R, Miyaji T, et al. Assessment of the mechanism of elemental incorporation into bivalve shells () based on elemental distribution at the microstructural scale [J]. Geochimica et Cosmochimica Acta, 2014,126:307-320.

[24] 古丸明,尾之内健次,柳瀬泰宏,等. EPMA (Electron Probe Micro Analyzer) による塩分濃度の異なる水域で採集されたヤマトツヅミ貝殼のSr/Ca比 [J]. 日本水産学会誌, 2009,75(3):443- 450.

[25] Siegele R, Orlic I, Cohen D D, et al. Manganese profiles in freshwater mussel shells [J]. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B - Beam Interactions with Materials and Atoms, 2001,181:593-597.

[26] 刘 彬,蒲德永,王志坚,等.椭圆背角无齿蚌贝壳棱柱层的结构 [J]. 四川动物, 2013,32(2):223-227.

[27] Machado J, Lopes-Lima M. Calcification mechanism in freshwater mussels: potential targets for cadmium [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2011,93(9):1778-1787.

[28] Jacob D E, Soldati A L, Wirth R, et al. Nanostructure, composition and mechanisms of bivalve shell growth [J]. Geochimica et Cosmochimica Acta, 2008,72:5401-5415.

[29] Gillikin D P, Dehairs F, Baeyens W, et al. Inter- and intra-annual variations of Pb/Ca ratios in clam shells (): a record of anthropogenic lead pollution? [J] Marine Pollution Bulletin, 2005,50(12):1530-1540.

[30] Liang F, Yang S, Sun C. Primary health risk analysis of metals in surface water of Taihu Lake, China [J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 2011,87:404-408.

[31] Bourgoin B P. A rapid and inexpensive technique to separate the calcite and nacreous layers inshells [J]. Marine Environmental Research, 1988,25(2):125-129.

[32] Rivero L E, Lares M L. A technique for the separation of the most recently deposited nacreous layer inshells for trace metal analysis [J]. Ciencias Marinas, 2004,30(2):343-347.

* 责任作者, 研究员, jiany@ffrc.cn

A preliminary study on elemental profile in the shell of freshwater bivalve Anodonta woodiana

CHEN Xiu-bao, JIANG Tao, LIU Hong-bo, SU Yan-ping, YANG Jian*

(Key Laboratory of Fishery Eco-Environment Assessment and Resources Conservation in Middle and Lower Reaches of the Yangtze River, Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuxi 214081, China). China Environmental Science, 2016,36(8)：2516~2521

An electron probe microanalyzer (EPMA) was used to analyze the content profiles of 19 elements (Ag, Al, Au, Ca, Co, Cu, Fe, Hf, Mg, Mn, Mo, Na, Re, Se, Sn, Sr, Tl, V, and Zn) in the shell (prismatic layer and nacreous layer) of freshwater bivalve. Results of both the line transect and map analyses clearly showed that the element contents generally decreased in the order of Ca, Hf, Re, Mn, Al, Co, Fe, Sr, Cu, Na, Au, Mg, Tl, Zn, Sn, Ag, V, Mo, and Se. Level of Mn in the nacreous layer was evidently higher than that of prismatic layer. Furthermore, Mn content in the nacreous layer of the umbo (0.087±0.045)% was significantly higher than that in the prismatic layer (0.030±0.025)% (<0.05). Likewise, Mn content in the nacreous layer nearby the ventral edge (0.072±0.055)% was significantly higher than that in the prismatic layer (0.044±0.025)% (<0.05). The present study can provide a better basis for selecting a more sensitive bioindicator in our undertaking “Freshwater Mussel Watch” project.

；shell；element microchemistry；EPMA；biomonitoring

X835

A

1000-6923(2016)08-2516-06

陈修报(1983-),男,江苏徐州人,助理研究员,博士,从事水域生态环境的评价与保护研究.发表论文19篇.

2016-01-05

国家自然科学基金项目(31502166);中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(2015JBFM13)