高效液相色谱法测定葵花籽中绿原酸的含量

贾国凯　徐　康　陈修文　陈小明*



高效液相色谱法测定葵花籽中绿原酸的含量

贾国凯徐康陈修文陈小明*

（湖南科技学院 化学与生物工程学院，湖南 永州 425199）

目的：采用高效液相色谱法测定湖南永州葵花籽中绿原酸的含量。方法：高效液相色谱法，采用Inertsustain –C18( 250 mm×4.6 mm，5μm)为色谱柱，柱温40℃，以乙腈(A)：0.4%磷酸( B)体积比为17:83做为流动相，流速1.0 ml/min，检测波长为327 nm，紫外检测器检测。结果：绿原酸在10 min内达到良好分离，线性范围分别为0.3μg～3.3 μg(r = 0.9991, n = 5)；平均加样回收率分别为92.7% ( RSD 0.43%)。结论：该方法简便，快速，精确，具有较好的重复性和稳定性，可作为葵花籽中绿原酸的质量控制方法。

高效液相色谱；葵花籽；绿原酸

绿原酸在植物界广泛存在，但含量较高的植物不多。国外多以咖啡豆和金银花为原料提取绿原酸，我国葵花籽资源丰富，年产量达125万吨，它还是一种健康食品，中医学认为，葵花籽仁性甘寒，有润肺平肝、治血病，透痈脓之功效。现代研究表明，葵花籽中富含维生素E、酚酸、不饱和脂肪酸、矿物质。经常食用，有助于降低胆固醇、高血压、高脂肪和有助于防治心脑血管疾病。但是，对于葵花籽中的绿原酸成分研究，国内未见有文献报道，为此，文章采用回流提取葵花籽中绿原酸成分，并采用高效液相色谱分析其含量，为进一步开发葵花籽提供理论依据。

葵花籽是向日葵的果实。向日葵属于菊科向日葵属。为一年生草本植物。别名葵花，我国古籍上又叫西番莲、丈菊、迎阳花等，在欧洲叫太阳花，还有些国家叫太阳草、转日莲、朝阳花等。葵花籽中含蛋白质、糖类和柠檬酸、酒石酸、绿原酸等有机酸。绿原酸具有广泛的生物活性，现代科学对绿原酸生物活性的研究已深入到食品、保健、医药和日用化工等多个领域。绿原酸是一种重要的生物活性物质，具有抗菌、抗病毒[1]、增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经系统等作用。

1　仪器与试剂

LC-20AT 高效液相色谱仪(日本岛津公司)，DAD 检测器(日本岛津公司)，岛津色谱工作站；Waters 600 高效液相色谱仪，ELSD-2000 蒸发光散射检测器( Waters 600 美国)，YAMATO 旋转蒸发仪(日本雅马拓公司)；AE240 分析天平(赛得利斯)；XMTD-8222 鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；DK-S 数显电热恒温水浴锅(上海浦东荣丰科学仪器有限公司)；KQ-400DB 超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司)。

葵花籽（湖南永州），绿原酸（中国药品生物制品检定所）；乙腈为色谱纯（Fisher Scientific公司）；水为去离子水；其余所需化学试剂均为分析纯。

2　方法与结果

2.1样品溶液的制备

准确称取有壳与去壳葵花籽原料4.0g，按照料液比1：10，加入50mL的70%乙醇溶液，温度80℃，回流提取2次，每次提取40min，进行抽滤，合并两次滤液[2]，浓缩至1mL~2mL，加甲醇溶液定容至50mL，备用。

2. 2 色谱条件

ODS-C18柱(4.6 mm×150 mm)，流动相为乙腈与0.4%磷酸混合液(体积比为17∶83)，0.45 um滤膜抽滤；等梯度洗脱，流速1.0 mL/min；柱温25 ℃；检测波长327 nm[3]。对照品绿原酸和葵花籽样品分离的色谱图见图1。

A.绿原酸对照品溶液

B.葵花籽供试品溶液

图1.绿原酸对照品（A）和样品（B）色谱图

2.2线性关系考察

精密称取绿原酸标准品1.02mg，用甲醇定容至1mL配制成1.02mg/mL的标准储备液。从标准储备液中各吸取0.2mL标准品溶液分别用甲醇定容至浓度为0.333mg/mL，0.200mg/mL，0.111mg/mL，0.059mg/mL，0.030mg/mL。在上述色谱条件下测定，分别注入高效液相色谱仪，进样量10μL。以标准品浓度为横坐标(X)，以相应的峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归。绘制标准品的标准曲线：y = 32547926.48x-129653.21说明绿原酸的浓度与吸光度在0.333～0.030mg/mL范围内呈现良好的线性关系。

2.3精密度试验

取对照品绿原酸溶液连续进样6次，测定峰面积，计算绿原酸的RSD为0.96%，表明仪器精密度良好[4]。

2.4重复性试验

取同一购买的葵花籽样品6份，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进行测定，测得绿原酸的平均含量( n = 6) 分别为5.8mg/g ，RSD为0.68%，表明本方法重复性良好。

2.5稳定性试验

取同一批葵花籽的供试品溶液，室温密闭放置，分别在制备后0 h、4 h、8 h、12 h、24h 进样测定绿原酸峰面积，RSD( n = 6) 为2.1%，表明供试品溶液在24h内稳定。

2. 6加样回收率试验

精密称取葵花籽约4.0g，共5份，精密加入对照品溶液1. 5 mL[3]，按“2. 1”方法制备供试品液，分别按“2. 2”项色谱条件进样分析，计算加样回收率和RSD。结果见表1。

表1.绿原酸回收率测定结果Table 1 Result of the recovery experiment of Chlorogenic Acid 成分样品量/g绿原酸含量/mg加入量/mg测得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/% 绿原酸4.0122.2580.03322.28890.9 4.0522.4900.03322.52296.9 4.0322.3740.03322.40490.992.70.43 4.0322.3740.03322.40490.9 4.0122.2580.03322.28993.9

3　讨　论

3.1 检测波长的选择

取对照品绿原酸溶液和提取液，用UV-2800光度计进行光谱分析，在波长400nm～200 nm范围进行扫描，绿原酸在320nm附近有特征吸收峰，提取液在波长400nm～200nm范围内连续扫描3次，对扫描图进行峰检，发现在327nm处分别有较强的吸收峰，故选定327nm为检测波长。

3.2流动相的选择

在实验过程中曾试过甲醇-水，乙腈-水溶液等为流动相，分离效果均不理想，色谱峰拖尾严重，而采用乙腈-0.4%磷酸水溶液后分离效果有明显的改善，且峰形均较好，无拖尾现象，故最后选择乙腈-0.4% 磷酸水溶液为流动相。

3.3提取方法确定

考察了60%甲醇，70%甲醇，100%甲醇，60%乙醇，70%乙醇，95%乙醇几种不同提取溶剂，对葵花籽中绿原酸提取率的影响，结果发现70%提取效果最好且杂质较少，对超声提取法和加热回流法的提取效果进行了比较，发现回流提取法提取绿原酸优于超声提取，但提取物中杂质较多，超声提取绿原酸优于回流提取。回流提取操作简单，节省时间，易于平行获取供试品液，故最终选择回流提取方法。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典1部[M].北京:化学工业出版社,2005.

[2]张维农,刘大川,胡小泓.葵花籽仁中提取绿原酸的研究[J].中国油脂,2002,(2):76-77.

[3]薛晓丽,高效液相色谱法测金银花中绿原酸的含量[J].江苏农业科学,2012,(2):296-297.

[4]刘圣金,狄留庆,吴德康,宋燕.高效液相色谱法测定杜仲中绿原酸的含量[J].中国中医药信息杂志,2006,(1):44-45.

（责任编校：何俊华）

2016－05－19

永州市科技局项目－迷迭香鼠尾草酸的纯化工艺及其应用研究。

贾国凯（1987－），男，山西曲沃人，硕士研究生，研究方向为有机合成。

陈小明（1983－），男，湖南永州人，工程师，硕士，研究方向为药物新技术、新工艺与新制剂。

Ｏ621.3

A

1673-2219（2016）10-0067-02