神经节苷脂和神经生长因子在大鼠不同严重程度脑损伤治疗中的协同作用

刘晓斌　李　民　侯明山　蔺鹏桢　缪星宇　杨　军陕西省人民医：神经外科，陕西西安710061

神经节苷脂和神经生长因子在大鼠不同严重程度脑损伤治疗中的协同作用

刘晓斌李民侯明山蔺鹏桢缪星宇杨军
陕西省人民医：神经外科，陕西西安710061

目的观察神经节苷脂（GM1）和神经生长因子（NGF）对患有不同严重程度脑损伤大鼠的治疗作用，以探讨GM1与NGF可能存在的协同作用以及两者治疗效果的差异性。方法140只10周健康的雄性SD大鼠分为正常组、假手术组、模型A组、模型B组、模型C组，使用电子颅脑损伤仪（eCCI）制备模型A/B/C，打击深度均为3mm，打击速度分别为3、4、5m/s。其中模型A/B/C组再分以空白组、GM1治疗组、NGF治疗组和GM1+NGF治疗组。给药后分别在24、48、72 h用ELISA方法检测血清中S100B和神经元特异性烯醇化酶（NSE）的含量。结果损伤发生后第24小时各组S100B和NSE含量均达到最高点，随后呈下降趋势；同一模型不同治疗组内，GM1+NGF治疗组下降趋势最显著（P＜0.05）；不同模型间，中度脑损伤模型的GM1+NGF治疗组下降最为显著（P＜0.05）。结论GM1和NGF联合使用治疗比单独使用GM1或者NGF效果要好，两者存在协同作用；而且GM1和NGF联合使用治疗对于中度脑损伤情况效果最佳。

GM 1；NGF；颅脑损伤；协同作用

［Avsteact］Ov jective To observe the therapeutic effect of ganglioside（GM1）and nerve growth factor（NGF）on the severity of brain injury in rats，and to explore the synergy and the difference of therapeutic effect between GM1 and NGF.M ethods A total of 140 10 weeks healthy male rats were randomly divided into 5 groups：normal group，sham group，model A group，model B group and model C group，then the traumatic brain injury model were prepared by electric Cortical Contusion Impactor（eCCI），the hit depth was 3 mm，the hit speed ofmodel A/B/C was 3 m/s，4 m/s and 5 m/s respectively.Then the model A/B/C was divided into 4 groups：blank group，GM1 group，NGF group and GM1+NGF group respectively.ELISA method was used to detect serum S100B and NSE concentration after treatment at24 h，48 h and 72 h respectively.Results S100B and NSE levels in each group had reached the highest point at 24 h after injury，and then decreased.Different treatment groups within the same model，GM1+NGF treatment group decreased themost significantly（P＜0.05））；between differentmodels，GM1+NG treatment group inmoderate brain injury model decreased themost significantly（P＜0.05）.Conclusion The therapeutic effect of GM1+NGF treatment group is better than GM1 or NGF，two drugs have synergistic brain protection，and the best therapeutic effect of GM1+NGF is to moderate brain injurymodel.

［Key woeds］GM1；NGF；Traumatic brain injury；Synergymechanism

颅脑损伤是临床上常见、多发的神经外科疾病，其发生率高居损伤中的第二位，我国每年死于创伤疾病的数十万中有一半来源于致命的颅脑损伤［1］。近年来，一些脑组织损伤特异性生化标志物，如胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、髓鞘碱性蛋白（MBP）、S100B蛋白和神经元特异性烯醇化酶（NSE）等得到了临床医生和研究人员越来越多的关注，其中尤以S100B蛋白和NSE蛋白最为显著，两者作为特异性标志物，在一定程度上可以反映出颅脑损伤的程度［2-3］。神经节苷脂（GM1）和鼠神经生长因子（NGF）是目前神经外科临床治疗颅脑损伤的常用药物，其中GM1有助于受损脑神经细胞神经元的功能恢复［4］，对脑损伤后继发神经的退化有保护作用［5］；而NGF对受伤的运动神经元有保护和修复作用，其可以加速神经纤维的再生和减轻继发性损伤［6］。也有研究证明，GM1和NGF间具有复杂的生物学作用，可以明显促进神经的再生行为［7］。本研究对不同程度颅脑损伤大鼠给予GM1和NGF治疗，通过检测S100B、NSE的变化，探讨GM1和NGF对不同程度颅脑损伤的治疗效果，以及探讨GM1与NGF之间是否存在协同作用。

1　材料与方法

1.1动物材料及试剂、仪器

选取生长至10周左右，健康成年雄性SD大鼠共140只，体重240～260 g（源自西安交通大学实验动物中心，合格证编号：SYXK（陕）2012-003）。

戊巴比妥钠（Sigma，USA），硫酸庆大霉素（西南药业），神经节苷脂（GM1）（厦门北大之路生物工程公司），鼠神经生长因子（NGF）（齐鲁制药），电子颅脑损伤仪（eCCI），NSE ELISA试剂盒（R&D Systems，USA）、S100BELISA试剂盒（R&D Systems，USA）。

1.2eCCI造模及模型的分级

140只SD大鼠分为正常组、假手术组、模型A组、模型B组、模型C组，其中正常组和假手术组各10只大鼠，造模组各40只大鼠。利用美国VCU大学设计的电子颅脑损伤仪（eCCI）制备TBI动物模型。实验前12 h大鼠禁食，但不禁水。在整个实验过程中，均为无菌操作。造模组大鼠腹腔注射2%戊巴比妥（50 mg/kg）进行麻醉处理，将大鼠俯卧固定在脑立体定向仪上。无菌条件下，在大鼠脑中线切开头皮，然后剥离骨膜，暴露出右顶骨。于冠状缝后3 mm，矢状缝中线旁2.5 mm处，用微型磨钻打一个直径为2 mm的骨孔，暴露硬脑膜，并保持硬膜完整。然后将大鼠移至eCCI打击操作台，分别设置合适的打击参数（模型A组，击打速度为3m/s，击打深度为3mm；模型B组，击打速度4m/s，击打深度3mm；模型C组，击打速度5 m/s，击打深度3 mm）［8］，撞击硬膜使脑组织瞬间形变。用硫酸庆大霉素处理切口，并用骨蜡封闭骨孔，然后缝合头皮切口。当观察到大鼠恢复自主呼吸后放回笼中单独饲养，实验过程中由于操作不当，共造成死亡大鼠5只，均在造模后1 h内发生死亡，通过补充新的大鼠并制作相应的TBI模型以保证了各组模型鼠数量。造模结束后分别在第24、48、72小时对实验大鼠进行神经功能行为检测，并通过国际公认的改良型大鼠神经功能缺失评分系统（mNSS）分别从平衡、反射、感觉和运动四个方面来评价大鼠的神经功能，评分范围0～18分，得分0分为正常，1～6分为轻度损伤，7～12分为中度损伤，13～18分为中度损伤［9］。正常组大鼠不做任何处理，假手术组大鼠只做开颅和缝合处理，不做打击处理。

1.3给药分组

模型A/B/C组分别再分为4个组，分别为空白组、GM1治疗组、NGF治疗组和GM1+NGF治疗组，每组10只SD大鼠。根据GM1和NGF用药执行标准，GM1治疗组给药模式为GM1 20mg/（kg·d）+生理盐水10mL/（kg·d），其中GM1浓度为2mg/mL；NGF治疗组给药模式为NGF 2 000 U/（kg·d）+生理盐水10mL/（kg·d），其中NGF浓度为200U/mL；GM1+NGF治疗组GM1 20 mg/（kg·d）+NGF 2 000 U/（kg·d）；空白组给予注射等量的生理盐水。各组均在大鼠造模结束后，放回笼中单独饲养前以腹腔注射法给药，每日一次，连续给药3 d。

1.4ELISA法测定蛋白表达水平

正常组、假手术组和各处理组分别于造模后第24、48、72小时采集眼眶的静脉血各1mL，4000 r/min离心处理后去血清，-20℃保存供ELISA法检测S100B和NSE含量。按照NSE ELISA试剂盒（R&D Systems，USA）、S100BELISA试剂盒（R&D Systems，USA）的方法分别测定各样品血清中NSE和S100B的含量。

1.5统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行数据统计处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差（One-Way ANOVA）分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1大鼠脑损伤建模与分级

正常组和假手术组在伤后72 h内的观察中mNSS评分均为0分，模型A组在造模后72 h内mNSS评分平均值为（4.98±0.35）分，为轻度损伤；模型B组在造模后72 h内mNSS评分平均值为（9.27±0.24）分，为中度损伤；模型C组在造模后72 h内mNSS评分平均值为（14.41±0.43）分，为重度损伤。且3个模型组之间的mNSS评分比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1　模型SD大鼠m NSS评分及分组（x±s）

2.2不同治疗组S100B蛋白含量变化分析

模型A/B/C中各空白组大鼠血清中S100B蛋白浓度相较于正常组和假手术组都有明显升高，而各给药组大鼠血清中S100B蛋白浓度在造模后第24小时达到峰值，随着时间的延长均呈下降趋势。见图1。GM1治疗组和NGF治疗组大鼠血清中的S100B蛋白浓度与空白组相较下降明显，差异有统计学意义（P＜0.05）；而两组之间的大鼠血清中S100B蛋白浓度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；GM1+NGF治疗组大鼠血清中NSE蛋白浓度分别与GM1治疗组和NGF治疗组相比较，在各个时间点均有降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

图1　各模型给药后各组大鼠血清中S100B蛋白含量变化曲线分析

表2　给药后各组大鼠血清中S100B蛋白含量测定（n=10，ng/L，x±s）

2.3不同治疗组NSE蛋白含量变化分析

模型A/B/C中各空白组大鼠血清中NSE蛋白浓度相较于正常组和假手术组都有明显升高，而各给药组大鼠血清中NSE蛋白浓度在造模后第24小时达到峰值，随着时间的延长均呈下降趋势。见图2。GM1治疗组和NGF治疗组大鼠血清中的NSE蛋白浓度与空白组相较下降明显，差异有统计学意义（P＜0.05）；而两组之间的大鼠血清中NSE蛋白浓度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；GM1+NGF治疗组大鼠血清中S100B蛋白浓度分别与GM1治疗组和NGF治疗组比较，在各个时间点均有降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

图2　各模型给药后各组大鼠血清中NSE蛋白含量变化曲线分析

表3　给药后各组大鼠血清中NSE蛋白含量测定（n=10，ng/L，x±s）

2.4GM 1和NGF在不同模型中协同效应分析

进一步分析各模型GM1+NGF治疗组S100B蛋白和NSE蛋白的下降趋势发现，相较于模型A组（轻度损伤）和模型C组（重度损伤），GM1+NGF治疗组的S100B蛋白含量下降趋势在模型B组（中度损伤）最为显著，差异有统计学意义（P＜0.05）；在第48小时差别最大。而NSE蛋白浓度检测结果显示，相较于模型A组和模型C组，GM1+NGF治疗组在模型B组显示出良好的治疗效果，在第1天就具有显著的下降趋势，差异有统计学意义（P＜0.05），在后续2 d内下降趋势逐渐加强。见表4。

3　讨论

颅脑损伤作为临床上常见、多发的神经外科疾病，其发生率高居损伤中的第二位，占全身损伤的10%～15%，我国每年死于创伤疾病的数十万中有一半来源于致命的颅脑损伤。随着社会经济的发展，颅脑损伤疾病在我国的发生率有上升的趋势。此外，颅脑损伤有很高的致残率和死亡率，这给家庭和社会带来了巨大的医疗负担［1］。

表4　不同模型中GM 1+NGF治疗组S100B和NSE下降趋势分析（%，x±s）

近年来，一些脑组织损伤特异性生化标志物，如GFAP、MBP、S100B蛋白和NSE等得到了临床医生和研究人员越来越多的关注，其中尤以S100B蛋白和NSE蛋白最为显著［2-3］。S100B蛋白存在于星形胶质细胞和雪旺细胞中，是中枢神经系统星形胶质细胞完整性的特异标志物［10］。当颅脑受到损伤后，中枢神经系统的细胞遭到破坏，进而S100B蛋白会由神经胶质细胞中渗入到脑脊液，然后通过已受到损伤的血脑屏障进入到外周血中［11］。因此，血清中的S100B蛋白浓度可以反映出星形胶质细胞的受损程度［12］，中枢神经系统受损患者，其脑脊液和血清中的S100B蛋白浓度会升高［13］。NSE主要存在于神经元和神经内分泌细胞中，其可以作为中枢神经系统神经元的特异性标志物，被认为是检测脑损伤和预后评估的指标［14］。颅脑受损伤，神经元死亡，NSE被释放到细胞间隙，进而破坏血脑屏障进入血液［15-16］。因此，当脑组织损伤程度越严重，受损的神经元会越多，血脑屏障受损也越高，而进入血液的NSE蛋白水平也越高［17］，所以血液中的NSE蛋白浓度在一定程度上可以反映出颅脑损伤的程度［18］。

GM1和NGF是目前神经外科临床治疗颅脑损伤的常用药物，其中GM1有助于受损脑神经元的功能恢复，对脑损伤后继发神经的退化有保护作用［19］；而NGF对受伤的运动神经元有保护和修复作用，其可以加速神经纤维的再生和减轻继发性损伤［20］。也有研究证明，GM1和NGF间具有复杂的生物学作用，可以明显促进神经的再生行为［7］。Kubota等［21］和张引成等［22］发现GM1能够介导NGF促进运动神经元再生的作用，并具有很好的效果；Duchemin等［23］研究证实GM1可以上调SD大鼠脑内NGF mRNAme的表达量；Cuello等［24］研究认为外源性GM1可能是通过一种Ca2+依赖性信号通道来发挥对NGF生物学作用的增强效果。

本次研究利用电子颅脑损伤仪（eCCI）制备患有不同程度TBI的SD大鼠模型，对不同程度颅脑损伤大鼠给予GM1和NGF治疗。结果显示，各模型A/B/C中GM1治疗组大鼠的S100B蛋白和NSE蛋白的浓度相较于为给予任何药物治疗的组别大鼠在3个时间点均有降低，且差异有统计学意义（P＜0.05）。这表明GM1能够有效降低S100B蛋白和NSE蛋白的表达，促进受损脑神经细胞的功能恢复，进而对颅脑产生保护作用。同样，在各模型A/B/C中NGF治疗组大鼠的S100B蛋白和NSE蛋白的浓度相较于为给予任何药物治疗的组别大鼠在3个时间点均有降低，且差异有统计学意义（P＜0.05）。这表明NGF对受伤的运动神经元具有保护和修复作用，其可以有效降低S100B蛋白和NSE蛋白的表达，并加速神经纤维的再生和减轻继发性损伤，促进受损神经元的恢复。此外，研究结果还发现，GM1与NGF均可以有效降低S100B蛋白和NSE蛋白的表达，且两个治疗组的S100B蛋白和NSE蛋白浓度无显著性差异，这说明两者对颅脑产生的保护作用无明显差异。

对于GM1+NGF治疗组的研究结果显示，使用GM1+NGF治疗组大鼠的血清中S100B蛋白和NSE蛋白浓度相较于与GM1组或NGF组均有下降，且差异有统计学意义（P＜0.05）。同时，相较于模型A（轻度损伤）和模型C（重度损伤），模型B（中度损伤）GM1+NGF治疗组大鼠的血清中S100B蛋白和NSE蛋白浓度下降幅度更大，且具有显著差异性。这表明，联合使用GM1和NGF治疗，两者间产生了协同保护作用，能够更大幅度地降低受损神经胶质细胞S100B蛋白和受损神经元细胞NSE蛋白的表达，促进受损脑组织的功能恢复，进而更好地对颅脑起到保护作用。

综上所述，本研究表明GM1和NGF均可有效降低急性颅脑损伤SD大鼠血清中的S100B蛋白和NSE蛋白含量，且GM1和NGF联合使用治疗具有协同增强的作用，这种增强作用对于中度颅脑损伤SD大鼠的治疗最为明显，这为今后GM1和NGF的研究以及临床应用提供了一定的参考和借鉴意义。

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Syneegy vetween GM 1 and NGF on the seveeity of veain injuey in eats

LIU Xiaobin LIMin HOU Mingshan LIN Pengzhen MIAO Xingyu YANG Jun

Department of Neurosurgery，Shaanxi Provincial People＇s Hospital，Shaanxi Province，Xi＇an 710061，China

R651.1

A

1674-4721（2016）08（c）-0045-06

2016-04-20本文编辑：赵鲁枫）

刘晓斌（1977.7-），男，硕士；研究方向：颅脑损伤。