化瘀祛湿方对早期膝骨关节炎滑膜成纤维细胞COX-2m RNA表达的影响

袁长深　梅其杰　秦　凯　段戡　曾明珠.广西中医药大学第一附属医：，广西南宁500；.江西省上饶县人民医：，江西上饶400；.广东省中医：，广东广州500

化瘀祛湿方对早期膝骨关节炎滑膜成纤维细胞COX-2m RNA表达的影响

袁长深1梅其杰1秦凯2段戡1曾明珠3
1.广西中医药大学第一附属医：，广西南宁530023；2.江西省上饶县人民医：，江西上饶334100；3.广东省中医：，广东广州510120

目的通过观察化瘀祛湿方对早期膝骨关节炎（KOA）患者滑膜成纤维细胞（FLS）中COX-2 mRNA表达的影响，阐释化瘀祛湿方对早期KOA治疗的作用机制。方法通过切断膝关节前交叉韧带和内侧副韧带，将成年健康新西兰雄性大耳白兔16只造成KOA模型，并将其随机分为生理盐水组（A组）、补肾活血组（B组）、化瘀祛湿组（C组）、塞来昔布组（D组），造模成功后6周，连续喂药7 d后处死实验兔，静脉穿刺采血，离心后取血清备用。将收集的早期KOA患者滑膜组织，经分离、纯化培养后，使用四代FLS用于实验，依次分别加入含A、B、C、D组药物的DMEM培养基中培养。重复离心后，应用RT-PCR检测四组含药血清干预后早期KOA患者FLS中COX-2mRNA的表达水平。结果早期KOA患者FLS经不同含药血清干预后均能检测到COX-2 mRNA，A组的COX-2mRNA表达水平最高，与B、C、D组比较差异有高度统计学意义（P＜0.01）；B组与C、D组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；C组与D组COX-2mRNA表达量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论化瘀祛湿方可有效抑制早期KOA患者FLS中COX-2mRNA的表达，在治疗早期KOA中发挥重要作用。

膝骨关节炎；化瘀祛湿方；滑膜成纤维细胞；COX-2

1.The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Guangxi Zhuang Autonomous Region，Nanning 530023，China；2.Shangrao People's Hospital，Jiangxi Province，Shangrao 334100，China；3.Traditional Chinese Medicine Hospital of Guangdong Province，Guangdong Province，Guangzhou 510120，China

［Avsteact］Ov jective Through observing the effect of Removing Blood Stasis and Eliminating Dampness Decoction for the expression of COX-2 mRNA of synovial fibroblasts（FLS）in patients with early knee osteoarthritis（KOA），to illustrate the mechanism of Removing Blood Stasis and Eliminating Dampness Decoction for the treatment of early KOA. M ethods Through cutting off the anterior cruciate ligament and medial collateral ligament of knee joint，60 healthy adult New Zealandmale special rabbitswasmade into KOA models，and they were randomly divided into normal saline group（group A），nourishing kidney and activating blood group（group B），removing blood stasis and eliminating dampness group（group C），Celecoxib group（group D）.Aftermakingmodels successfully for 6 weeks，the experimental rabbits were put to death after continuousmedicine feeding for 7 d，collecting blood through venipuncture，the serum was taken as standby application after centrifugation.The collected synovial tissues of patients with early KOA were taken separation and purification culture，so as to be used in the experiment by the fourth generation of FLS，where were added into DMEM medium including the medicines of group A，B，C，D respectively.After repeated centrifugation，RT-PCR was used to detect the expression of COX-2 mRNA of FLS in the patients with early KOA after intervention bymedicated serum of the four groups.Results After intervention by differentmedicated serum for FLSof patientswith early KOA，COX-2 mRNA could be detected in all patients，the expression of COX-2 mRNA in group A was the highest，which had highly statistically significant differences compared with group B，C，D（P＜0.01）；group B had statistically significant differences compared with group C，D（P＜0.05）；the expression of COX-2mRNA between group C and group D had no statistically significant difference（P＞0.05）.Conclusion Removing Blood Stasis and Eliminating Dampness Decoction can inhibit the expression of COX-2 mRNA of FLS in the patients with early KOA effectively，which plays an important role in the treatment of early KOA.

［Key woeds］Knee osteoarthritis；Removing Blood Stasis and Eliminating Dampness Decoction；Synovial fibroblasts；COX-2

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一组以关节软骨病变为主要病理特征的临床综合征。在KOA病变过程中，滑膜的炎性介入是加速软骨退变且诱发临床症状的重要因素之一。采用化瘀祛湿方可有效抑制滑膜炎，缓解早期KOA的病情［1］。笔者在前期基础上进一步观察化瘀祛湿方对早期KOA滑膜成纤维细胞COX-2mRNA表达的影响，探讨其可能的作用机制，为临床应用提供依据。

1　材料与方法

1.1实验分组

选择成年健康新西兰雄性大耳白兔16只（广西中医药大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK桂2014-0002，体重2.0～2.5 kg），并予编号，按随机数字表法随机抽取8只分成4组：生理盐水组（A组）、补肾活血组（B组）、化瘀祛湿组（C组）、塞来昔布组（D组），每组2只。

1.2造模与处理

通过切断膝关节前交叉韧带和内侧副韧带制造兔KOA软骨退行性变动物模型，造模方法参照前期动物造模方法［1］。造模后使用甲硝唑、生理盐水分别冲洗后予止血，缝合关节囊及皮肤。术后肌注青霉素20万U/（d·只），连续3 d。采用分笼标准饲养，自由活动。

1.3含药血清备制

造模成功后6周，开始喂药。按人和动物体表面积比计算动物等效给药量［体表面积计算公式为Mech-Rubner公式：A=K×（W2/3）/1000，其中A为体表面积，以m2计算，W为体重，K为常数，计算后得出兔每日剂量为0.21 g/kg］，以实验动物剂量的10倍进行灌胃，每天上午、下午各1次，间隔8 h，连续灌胃7 d。药物组成与剂量：①化瘀祛湿方：丹参15 g、当归10 g、川芎10 g、川牛膝10 g、苍术15 g、半夏10 g、陈皮10 g、白术10 g；②补肾活血方：桑寄生15 g、补骨脂10 g、杜仲10 g、肉苁蓉10 g、延胡索9 g、牛膝12 g。③塞来昔布胶囊0.2 g（辉瑞制药有限公司生产，批准文号：国药准字J20050072）。为提高实验结果的重复性，使用由江阴天江药业有限公司生产的单味中药浓缩颗粒剂组配，并且要求同一批号。使用时拆开胶囊，按体表面积折算动物的等效剂量，再配成10 mL/d水溶液灌胃，连续给药1周。正常兔以生理盐水10 mL/d灌胃。在最后1次全天药量灌胃（灌胃前禁食不禁水12 h）90 min后，麻醉（盐酸氯胺酮注射液）下经耳背中央动脉穿刺采血，4℃过夜，2500 r/min离心25min，取血清0.22μm滤膜抽滤、分装，56℃、30min灭活、-20℃保存备。生理盐水对照组灌以等量生理盐水。

1.4滑膜准备

KOA早期滑膜组织均取自住：患者。患者为40～70岁患者8例，病症诊断符合以下诊断标准。经膝关节镜手术获取病变滑膜组织。诊断标准：①西医诊断标准：采用中华医学会骨科学分会制订的《骨关节炎诊治指南》［2］（2007版）中的KOA诊断标准。②膝关节影像学诊断标准：参照Kellgren-Lawrence的分级标准［3］（早期：0～2级；晚期：3～4级）。③中医证候诊断标准：参照郑筱萸［4］主编的《中药新药临床研究指导原则》（2002年修订版）诊断标准。病例纳入标准：①符合上述诊断标准；②年龄40～70岁；③病情X线分级属0～Ⅱ级的患者；④基本了解试验目的并能配合本治疗方案者。排除标准：①重叠有其他风湿性疾病者；②合并有严重的心血管、脑血管、肺、肝、肾和血液系统原发疾病及精神病患者；③2个月内接受过激素治疗者；④孕妇或哺乳期妇女；⑤不合作者。

1.5方法

1.5.1标本取材关节镜下夹取滑膜组织，在无菌条件下立即置于预先盛有含青霉素200 kU/L、链霉素200 mg/L的D-Hank液中浸泡并漂洗3遍，减少污染机会，24 h内分离培养。

1.5.2成纤维样滑膜细胞（FLS）原代培养FLS原代培养采用不加消化酶人工贴壁培养，根据笔者前期实验步骤进行培养［2］。

1.5.3FLS的传代培养FLS的传代培养根据笔者前期实验步骤进行培养［5］，直至培养第Ⅳ代细胞。

1.5.4含药血清对滑膜细胞的干预取第Ⅳ代细胞以1×105/mL传代接种于培养瓶中，分成4组，分别加入含生理盐水、补肾活血方、化瘀祛湿方、塞来昔布含药血清的DMEM培养基（自Gibico公司），连续培养24 h。重复离心后，收集上清，-20℃冻存待测。

1.5.5FLS细胞总RNA的提取①往面积贴壁细胞加入Trizol 1mL，充分振荡；②加入氯仿0.2mL，充分振荡，孵育、离心后取1.5 mL致Eppendorf管；③加与上清液等体积的异丙醇，上下翻转5次摇匀，-20℃孵育样品20min，4℃12 000 r/min离心10min，吸去上清液；④加75%乙醇（含DEPC水）800μL洗涤沉淀1次，4℃7500 r/min离心5 min，吸弃乙醇；⑤在空气或真空干燥5～10min（不要完全干燥），再加DEPC处理水溶解RNA，-80℃保存备用。若长期保存，加入2.5倍体积乙醇，置-80℃保存。

1.5.6逆转录反应①RNA短暂离心；②将11μL的DEPC水和RNA（1μg）放入EP管内，置于冰上，使RNA终浓度为0.5μg/μL，再加入Oligo（dt）1μL，轻轻混合均匀，短时间离心（RNA=1/总RNA浓度=1/ OD260×6，DEPC水=11-RNA）；③依次加入4μL的5×buffer，1μL的核糖核苷酸酶抑制剂，2μL的10 mm dNTPMIXTURE，1μL的M-MLV逆转录酶后轻轻混合均匀，短时间内离心；④将混合物置于42℃，60 min。70℃加热5 min，中止上述反应，置于冰上。

1.5.7实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）检测RT-PCR引物由PrimerPremier6.0设计引物，Oligo7评估引物，最后由上海生工合成引物（表1）。按SYBR Green染料法荧光定量RT-PCR检测：为最大程度保证实验结果，在打开之前将其融解，并于微型离心机上轻微离心；准备100×浓度的PCR引物溶液（30μmol/L）；将反应管置于冰上，在50-μL的单个PCR反应体系中，依次加入Fast Start Universal SYBR Green Master（ROX）、正向引物（30μmol/L）、反向引物（30μmol/L）、水、PCR等级cDNA反应液组分；并按程序运行PCR仪（图1）。反应结束后确认RT-PCR的扩增曲线和融解曲线。

表1　引物序列及相关信息

图1　PCR程序运行

1.6统计学方法

采用SPSS 18.0进行分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1扩增曲线分析

在扩增曲线上的线性增长期，分析生成相应的标准曲线图（图2）。根据标准曲线的斜率与扩增效率之间的关系，算出特异性内参序列和目的基因的扩增效率分别为95.7%和97.9%，此数值在PCR扩增效率90%～110%范围内，即可认为该标准曲线是可靠的。实验以β-actin为内参做校正，与配对的对照组（生理盐水组）相比，所有实验组的FLSCOX-2 mRNA的相对表达量呈低表达水平（图3）。

图2　内参基因与目的基因的扩增曲线

图3　茁-actin和COX-2 mRNA标准曲线

2.2PCR扩增过程中的熔解曲线分析

SYBR Green是一种在PCR扩增中不显示特异性的DNA双链结合染料，可通过观察熔解曲线是否有出现非特异性条带判断其特异性。本实验中可看出的熔解曲线见图4。

图4　内参基因与目的基因的熔解曲线

2.3应用2-ΔΔCt进行相对表达量的分析

比较各组间早期KOA患者FLS中的COX-2 mRNA表达量，A组要明显高于B、C、D三组（P＜0.01）；在实验组间，B组约是D组的3倍（P＜0.05）、C组的2倍（P＜0.05），C组与D组两组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5、表2。

图5　COX-2 m RNA的相对表达量

表2　A组患者和不同含药血清组KOA患者FLS COX-2 m RNA的CT值比较

2.4RT-PCR电泳图

在本研究中，为进一步明确RT-PCR扩增产物的特异性，以COX-2基因cDNA为模板进行普通PCR，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳图，结果可见大小约190 bp的单一条带，未见有杂带及产物二聚体。见图6。

图6　COX-2 RT-PCR产物和茁-actin RT-PCR产物电泳图

3　讨论

滑膜增生和炎症是KOA的重要组成部分和重要特征之一。在KOA早期，滑膜的增生和纤维化，分泌炎症介质和软骨降解酶，可能是KOA发病的重要因素，且参与其整个病理过程［6］，从滑膜治疗KOA将成为一个新的研究方向［7］。

滑膜炎症是关节内局限性炎症病因所在［8］。在症状性KOA患者中不仅存在滑膜增厚现象，而且与关节疼痛程度呈正相关［9］；而在有炎症的KOA滑膜组织中，滑膜分泌的炎性介质程度与滑膜组织的层次相关［10］，特别是髌下脂肪垫滑膜炎症，过度表达的一些炎症介质、细胞因子等［11］，不仅加重关节症状（肿胀、疼痛、积液等），而且加速KOA进展。因此，将炎症滑膜作为治疗KOA的药物靶点［12］，有助于抑制滑膜病变，减少滑膜的炎症，延缓原发性KOA的进展［13］。

在KOA的FLS中，可产生大量的炎性细胞因子及免疫反应介质，且COX-2 mRNA高表达［4］。由于COX-2 mRNA表达且与炎症和疼痛有关，那么，对COX-2的抑制作用越强，抗炎作用就越强［14］。通过抑制COX-2的表达，可减少其诱导产物前列腺素的合成，有效缓解关节炎症，减轻关节疼痛等［15］，有效抑制滑膜组织中COX-2的表达，将是治疗KOA的重要环节。

为了探索滑膜组织在OA病程中的作用机制，从滑膜炎症的主体——FLS入手，通过对FLS进行原代培养，观察COX-2 mRNA的表达对KOA的影响。在本研究中，采用RT-PCR方法测定早期KOA患者体外培养FLS中COX-2mRNA表达，结果显示COX-2 mRNA有较高水平的表达，与前期研结果相符［5］，表明COX-2在早期KOA中起到重要作用（实验组与A组比较P＜0.01）（图3）。

虽然KOA病机、证候复杂，但早期或急性发作期以瘀湿为主，专行“化瘀、祛湿”，方能奏效［16］；而类似的治疗方法亦取得了较好的效果［17-20］。

在采用2-ΔΔCt进行相对表达量的分析中，A组的COX-2 mRNA表达水平最高，与D、C组及B组比较有明显差异（P＜0.05）。而在本研究中，由于活血化瘀类药物可通过改善局部微循环，减轻滑膜水肿，缓解关节内高压，直接或间接消除关节内局限性炎症，所以补肾活血方对早期KOA中FLS的COX-2 mRNA表达有一定的抑制作用（B组与A组比较P＜0.01），但其作用甚微。针对“血瘀、痰湿”的病机，采用化瘀祛湿方处理，其效果与塞来昔布类似（P＞0.05），可能与此方通过干预早期KOA诱导型一氧化氮合酶（iNOS）炎症途径发挥作用相关［1］，通过抑制滑膜中iNOS的表达，减少iNOS与COX-2结合，降低合成NO，减弱NO对COX-2的修饰作用［21］。通过抑制COX-2mRNA的表达，可有效降低前列腺素的合成，可能与调节COX-2 mRNA的表达水平发挥COX-2抑制剂样作用相关。

化瘀祛湿方通过抑制早期KOA患者FLS中COX-2 mRNA表达水平，在治疗早期KOA作用机制中发挥重要作用。

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Effect of Removing Blood Stasis and Elim inating Dam pness Decoction foe the expeession of COX-2 m RNA of synovial fiveov lasts in eaely knee osteoaetheitis

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1674-4721（2016）08（c）-0040-06

2016-04-15本文编辑：张瑜杰）

广西中医药民族医药自筹经费科研课题（GZZC14-17）。

，长深（1978-），男，硕士研究生，主要从事骨与关节疾病的基础与临床研究，擅长骨与关节疾病的中西医治疗。

段戡（1964-），男，博士研究生，主任医师，主要从事骨与关节疾病的防治，擅长髋膝关节疾病的治疗。