IMRT、VMAT模式照射离体人肺癌细胞的生物学效应研究

2016-10-13董俊林朱定清王思阳龚五星李小亮张振林广东省珠海市人民医广东珠海59000澳门大学澳门999078中山大学第五附属医广东珠海59000

中国医药导报 2016年24期

董俊林　赵　静　朱定清　王思阳　龚五星　李小亮　张振林.广东省珠海市人民医：，广东珠海59000；.澳门大学，澳门999078；.中山大学第五附属医：，广东珠海59000

董俊林1赵静2朱定清1王思阳3龚五星1李小亮1张振林1
1.广东省珠海市人民医：，广东珠海519000；2.澳门大学，澳门999078；3.中山大学第五附属医：，广东珠海519000

目的观察调强适形放射治疗（IMRT）、容积旋转调强放射治疗（VMAT）模式照射离体人肺癌细胞的生物效应，研究IMRT、VMAT模式放疗照射的作用机制，为制订合理的临床放疗方案提供理论依据。方法选取人肺鳞癌细胞SK-MES-1、人肺小细胞癌细胞NCI-H446，分别进行体外琼脂悬浮克隆培养法建立肿瘤模型。分别使用9个不同的照射剂量点进行急速照射研究，照射3min后计算细胞存活分数，采用GraphPad Prism软件处理数据，根据线性二次方程拟合细胞存活曲线，再把呈指数生长期的SK-MES-1、NCI-H446分别分成四个组：①VMAT模式照射组（直线型加速器能量为6 MV 6min照射）；IMRT模式15min照射组；IMRT模式30min照射组；IMRT模式45min照射组。每组照射总量为8 Gy，1次/d，2 Gy/次，4 d内完成。最后，采用克隆分析法计算细胞的存活分数，对比IMRT模式和VMAT模式的放射特点及生物效应。结果①急速照射完成后，分析得到SK-MES-1、NCI-H446细胞的放射生物学参数。SK-MES-1细胞各参数详细数值分别为（D0、Dq、N值、α值、β值、α/β值）：0.87 Gy、0.48 Gy、3.6、0.17 Gy-1、0.091 Gy-2、1.87 Gy；NCI-H446细胞以上各参数数值分别为0.61 Gy、0.35 Gy、4.0、0.98 Gy-1、0.089 Gy-2、11.01 Gy。②总量为8 Gy的4 d照射中，SK-MES-1细胞各照射组（VMAT模式照射组和IMRT模式15、30、45min照射组）的细胞存活率分别为7.25%、8.95%、9.63%、11.32%，IMRT模式照射下的细胞存活率较VMAT模式明显增加。NCI-H446细胞以上各组照射后的细胞存活率分别为0.192%、0.205%、0.208%、0.209%，差异不明显。结论人肺鳞癌细胞SK-MES-1的细胞放射敏感性（D0、N值）相对人肺小细胞癌细胞NCI-H446更低，亚致死性损伤修复能力（Dq值和α/β值）相对NCI-H446细胞更强，剂量率改变对其放射生物效应影响明显，IMRT模式单次剂量输出时间延长导致SK-MES-1细胞生存率增加，NCI-H446细胞增加不明显。

人肺癌细胞；调强适形放射治疗；容积旋转调强放射治疗；生物效应

1.Zhuhai People's Hospital，Guangdong Province，Zhuhai 519000，China；2.University of Macau，Macau 999078，China；3.the Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangdong Province，Zhuhai 519000，China

［Avsteact］Ovjective To observe the biological effects of intensity-modulated radiotherapy（IMRT）and volumetric modulated arc therapy（VMAT）irradiation for the human lung cancer cells in vitTo，and to study the mechanism of IMRT and VMAT irradiation，in order to provide evidence for formulating reasonable clinical radiotherapy plan. M ethods The human lung squamous carcinoma cells SK-MES-1 and human lung small cell cancer cells NCI-H446 were selected to establish tumor model by agar suspension culture method in vitTo，then the cells were given rapid radiation research at 9 dose levels.After irradiation for 3 min，the survival percentage of cells was calculated，GraphPad Prism software was used to process data，the cell survival curve was fitwith linear-quadratic formula，then the SK-MES-1，NCI-H446 at exponential growth phase were divided into four groups：VMAT irradiation group（the energy of linear accelerator was 6 MV，for 6 min）；IMRT irradiation for 15 min group；IMRT irradiation for 30 min group；IMRT irradiation for 45 min group.The total irradiation of each group was 8 Gy，once a day，2 Gy every time，finished in 4 days.At last，the cloning assay was used to calculate the survival rate of cells，to compare the radiation characteristics and biological effects between IMRT model and VMATmodel.Results①After finishing rapid radiation，the radiobiological parameters ofSK-MES-1，NCI-H446 cellswere achieved.The detailed numerical value of each parameter of SK-MES-1 cells（D0，Dq，N value，αvalue，βvalue，α/βvalue）was 0.87 Gy，0.48 Gy，3.6，0.17 Gy-1，0.091 Gy-2，1.87 Gy respectively；which of NCI-H446 cells was 0.61 Gy，0.35 Gy，4.0，0.98 Gy-1，0.089 Gy-2，11.01 Gy respectively.②In the irradiation of 4 d with 8 Gy，the survival rate of SK-MES-1 cells in all groups（VMAT irradiation group and IMRT irradiation for 15，30，45min group）was 7.25%，8.95%，9.63%，11.32%respectively，the survival rate under the IMRT irradiation was higher than that of VMAT irradiation.The survival rate of NCI-H446 cells in the groups above was 0.192%，0.205%，0.208%，0.209%respectively，the difference was not obvious.Conclusion The cellular radiosensitivity（D0，N value）of human lung squamous carcinoma cells SK-MES-1 is lower than that of human lung small cell cancer cells NCI-H446，the sublethal damage repair capacity（Dq value andα/βvalue）is stronger than that of NCI-H446，the changes of dosage rates has significant influence for the radiobiological effect，the prolonged single dose output time of IMRTmodel lead to the increase the survival rate of SK-MES-1 cells，without obvious increase in NCI-H446 cells.

［Key woeds］Human lung cancer cells；Intensity-modulated radiotherapy；Volumetricmodulated arc therapy；Biological effects

肺癌（1ung cancer）的发病率及死亡率呈不断上升趋势，在20世纪末已成为各种癌症死亡的首要原因，对人类健康的威胁越来越严重［1］。大部分肺癌患者确诊时已经处于中晚期或晚期，不可以接受手术治疗，只能选择以放射治疗为主的综合治疗模式［2-3］。因此，研究寻找非小细胞肺癌患者出现放射抗拒性的规律，寻找放射增敏的方法是提高治愈率的途径之一。而肺癌细胞的生物学效应变化情况对于疾病的发展转归有积极的反应价值［4-5］，因此对人肺癌细胞的生物效应进行变化观察的价值较高，尤其是对于不同放疗方式对肺癌细胞的影响情况研究极为必要，因此本研究针对肺癌细胞在离体状体下进行调强适形放射治疗（intensitymodulated radiotherapy，IMRT）、容积旋转调强放射治疗（volumetric modulated arc therapy，VMAT）模式照射的生物效应进行研究。

1　对象与方法

1.1对象

本研究采用临床常见肿瘤人肺鳞癌细胞SKMES-1、人肺小细胞癌细胞NCI-H446，因鳞癌和小细胞肺癌对于放射治疗的敏感度相对好于腺癌，因此在研究中应选取此类癌细胞进行研究，将其分别进行体外实验，研究模拟调强放疗技术的照射时间及照射剂量对放射生物效应的影响。所用人肺鳞癌细胞SKMES-1购自中国科学：上海细胞库，人肺小细胞癌细胞NCI-H446由中山大学实验动物中心提供。

1.2设计和分组

实验采用指数生长期细胞进行，共分为两个部分：急速照射-确定细胞放射生物学参数；常规照射效应分析（IMRT模式照射组和VMAT模式照射组），研究模拟调强放疗技术的照射时间及照射剂量对放射生物效应的影响。进行常规照射效应分析时，把呈指数生长期的SK-MES-1、NCI-H446细胞分别分成四个组：①VMAT模式照射组（直线型加速器设定能量为6 MV 6 min照射）；②IMRT模式15 min照射组；③IMRT模式30 min照射组；④IMRT模式45 min照射组。

1.3方法

1.3.1细胞培养方法［4］将人肺鳞癌细胞SK-MES-1、人肺小细胞癌细胞NCI-H446培养于PRMI-1640培养基中。PRMI-1640培养基由10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素组成。培养时，将以上两种人肺癌细胞制成单细胞悬液，置于37℃、5%CO2培养箱培养。细胞培养时，保证细胞贴壁生长均匀，以确保细胞能够营养均匀，同步生长。

1.3.2获得细胞放射生物学参数［4-5］把人肺鳞癌细胞SK-MES-1、人肺小细胞癌细胞NCI-H446按各剂量点要求接种，10 h内对四种人肺癌细胞分别进行9个剂量点的急速照射（包括0、0.4、0.6、1、2、4、6、8、10 Gy共9个剂量点），照射持续时间为3min。然后分别对SK-MES-1、NCI-H446细胞进行离体IMRT、VMAT模式照射。模拟IMRT照射共分为三组进行，即IMRT模式15、30、45 min照射组，各组所含照射剂量点同于急速照射组，每个剂量点分7次照射，其间分别为2.5、5、7.5 min，照射完成总时间分别15、30、45min。IMRT模式照射采用西门子医用直线加速器的6 MV射线照射，剂量率为3.6 Gy/min。VMAT模式照射采用6 MV直线加速器持续照射。SK-MES-1细胞接种细胞数5×103个，NCI-H446细胞接种细胞数105个。各组每天照射1次，每次给予2 Gy的放射治疗，持续治疗4 d。放射治疗结束后，根据克隆分析法计算细胞的存活分数，对比IMRT模式和VMAT模式的细胞生物学特点。

1.3.3采用克隆分析法计算细胞的存活分数［4］克隆形成实验：照射结束后将所有细胞置于37℃、含5% CO2气体的恒温恒湿培养箱内培养。10 d后除去培养液，用无水乙醇固定细胞后使用Giemsa液对细胞核染色。染色后将残留的Giemsa液冲洗干净；显微镜下计算细胞存活数。细胞存活数只计算＞50个的细胞的克隆数作为存活细胞。另外克隆率=集落形成数/接种细胞数。

1.4观察指标

采用GRAPHPAD Prism 4.0软件进行检验分析，根据线性二次方程（LQ）模式拟合细胞存活线，并计算LQ模型［S=exp（-αD-βD2）］，不完全修复模型［S= exp（-αD-βgD2）］（D0=1/K）［4，6］。分别求出肺癌细胞的D0、Dq、α、β、α/β。

离体细胞照射试验中，细胞存活率（SF）可表示放射生物效应（SF=1/α）；D0反映了细胞对高剂量放射治疗的敏感性，敏感性与D0值的大小成正比；准阈剂量Dq表示细胞亚致死性修复能力，修复能力的强弱与Dq值的大小成正比；外推数N反映细胞内所含放射敏感区域数，其是存活曲线直线部分的延长线与纵轴相交处的数值。线性二次方程中，参数α决定低剂量下损伤的程度，系数β反映亚致死性损伤修复能力。

2　结果

2.1不同照射剂量下SK-MES-1及NCI-H 446细胞克隆形成率及百分存活率

相同的照射条件下，人肺鳞癌细胞SK-MES-1、人肺小细胞癌细胞NCI-H446细胞克隆形成率及存活率与照射剂量之间的关系显示，随着照射剂量的升高，克隆形成率及存活率均降低。见表1。

表1　SK-MES-1尧NCI-H446细胞克隆形成率及细胞存活率（%，x±s）

2.2SK-MES-1、NCI-H 446细胞单靶多击数学模型拟合结果及LQ模型拟合结果

细胞单靶多击数学模型及LQ模型拟合结果分析，SK-MES-1细胞D0值为0.87 Gy，Dq值为0.48 Gy，N值为3.6；NCI-H446细胞D0值为0.61 Gy，Dq值为0.35 Gy，N值为4.0。以LQ模型拟合，得出SK-MES-1细胞α值为0.17 Gy-1，β值为0.091 Gy-2，α/β值为1.87 Gy；NCI-H446细胞α值为0.98 Gy-1，β值为0.089 Gy-2，α/β值为11.01 Gy。

2.3IMRT、VMAT模式照射下K-MES-1、NCIH 446细胞存活率

SK-MES-1细胞VMAT组细胞存活率为7.25%，IMRT模式15、30、45 min照射组细胞存活率高于VMAT模式照射组。NCI-H446细胞VMAT模式照射组细胞存活率为0.192%，IMRT模式15、30、45 min照射组细胞存活率与VMAT组比较差异不明显。见表2。

表2　SK-MES-1尧NCI-H446细胞分别在IMRT尧VMAT模式照射下的存活率（%）

3　讨论

放射治疗的主要目的是在保护正常组织的前提下，提高肿瘤区域的放射线剂量，最大限度地杀死癌细胞，提高放射治疗的治疗增益比［7］。IMRT［8-9］是根据肿瘤靶区的形状调整照射视野的形状及视野内的照射剂量，使得照射视野的形状与肿瘤靶区的形状尽可能一致，保证靶区内及表面的照射剂量均匀相等。VMAT［10］是在IMRT的基础上，不断改良照射技术，研发得到的一种可以在较短时间内完成IMRT同等照射剂量的一种新型放射治疗方法。本研究选用人肺鳞癌细胞SK-MES-1、人肺小细胞癌细胞NCI-H446，分别进行体外实验，研究IMRT模式照射时间及照射剂量对放射生物效应的影响，并与VMAT模式进行了比较。结果发现本研究中的SK-MES-1、NCI-H446细胞在0.4、0.6 Gy两个剂量点都没有发现低剂量时的超敏现象；同时，总剂量升至10 Gy后，生物效应亦无提高。比较SK-MES-1、NCI-H446细胞的生物学参数，结果表明SK-MES-1细胞的细胞放射敏感性（D0、N值）相对NCI-H446细胞低，亚致死性损伤修复能力（Dq值和α/β值）相对NCI-H446细胞更强。人肺鳞癌细胞SK-MES-1生存率随着IMRT模式单次剂量输出时间延长（15、30、45 min）逐渐增加，而NCI-H446细胞增加不明显。较之IMRT模式，VMAT组细胞生存率更低。说明，在照射总剂量相同的条件下，随着各组IMRT模式单次剂量照射时间的不断延长（15、30、45 min），照射之间的间歇次数增加，照射相对剂量率逐渐降低［4］，使得SK-MES-1生存率不断增加，从而降低放射生物效应和放射疗效；与SK-MES-1细胞相比，NCI-H446细胞的分化程度较低，IMRT模式照射时间的延长对其放射疗效无明显影响。VMAT单次照射的时间较短，从而增加单位时间内的剂量率，提高放射治疗的增益比［11-13］。本研究提示，VMAT模式照射比IMRT模式更加具有优势，杀死更多的癌细胞，对正常组织的放射损伤更低。从最优化理论的角度来看，放射治疗计划应该在提高肿瘤局部控制率的同时充分考虑正常组织的耐受剂量［14-16］，尽可能降低发生正常组织并发症的概率［17-20］。

综上所述，人肺鳞癌细胞SK-MES-1的细胞放射敏感性（D0、N值）相对人肺小细胞癌细胞NCI-H446低，亚致死性损伤修复能力（Dq值和α/β值）相对NCI-H446细胞更强，剂量率改变对其放射生物效应影响明显，IMRT模式单次剂量输出时间延长导致SK-MES-1细胞生存率增加，NCI-H446细胞增加不明显。

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Study on the viological effects of IMRT and VMAT ieeadiation foe the human lung cancee cells in vitro

DONG Junlin1ZHAO Jing2ZHU Dingqing1WANG Siyang3GONGWuxing1LIXiaoliang1ZHANG Zhenlin1