趋化因子受体4在卵巢上皮性癌中的表达及意义*

陈国庆， 王兴新， 訾　聃

(1.贵州医科大学附院 妇产科， 贵州 贵阳　550004； 2.威宁县人民医院 妇产科， 贵州 威宁　553100 )



趋化因子受体4在卵巢上皮性癌中的表达及意义*

陈国庆1，2**， 王兴新2， 訾聃1***

(1.贵州医科大学附院 妇产科， 贵州 贵阳550004； 2.威宁县人民医院 妇产科， 贵州 威宁553100 )

目的： 观察卵巢上皮性癌(EOC)中趋化因子受体4(CXCR4)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、表皮生长因子受体(EGFR)和增殖细胞核抗原(Ki-67)的表达及其与临床病理特征间的关系。方法： 应用免疫组化法检测40例卵巢上皮性癌(EOC组)组织和10例卵巢良性肿瘤组织(对照组)中CXCR4阳性表达率，同时检测EOC患者癌组织中Cyclin D1、EGFR和Ki-67表达水平，分析CXCR4、Cyclin D1、EGFR及Ki-67在EOC患者癌组织中的阳性表达率与患者年龄、组织学分级、是否有淋巴转移及TNM分期的关系，采用Spearman秩相关分析EOC患者癌组织中CXCR4表达与EGFR、Cyclin D1及Ki-67表达的相关性。结果： 对照组中CXCR4的阳性表达率(20%)低于EOC组(57.50%)，差异有统计学意义(P<0.05)；EOC患者癌组织中的CXCR4的阳性表达率与EOC患者临床分期、组织学分级及有无淋巴转移有关(P<0.05)，与年龄无关(P>0.05)；EOC患者中Cyclin D1阳性表达率与临床分期、组织学分级有关(P<0.05)，而与年龄、有无淋巴结转移无关(P>0.05)；EGFR与Ki-67的过表达率与临床分期有关(P<0.05)，而与年龄、组织学分级及有无淋巴转移无关(P>0.05)；EOC患者癌组织中CXCR4的阳性表达与Cyclin D1的阳性表达、EGFR的过表达及Ki-67的过表达之间呈现正相关性(r=0.535、0.506、0.490，P<0.05)。结论： CXCR4、Cyclin D1、EGFR和Ki-67的联合检测对EOC的发生、预后判断、治疗选择有一定的参考意义。

卵巢肿瘤,上皮性； 趋化因子受体4； 细胞周期蛋白D1； 表皮生长因子受体； 免疫组织化学； 染色法

卵巢癌的发病率居妇科肿瘤第3位，病死率居第1位，而卵巢上皮性癌(epithelial ovarian cancer，EOC)在卵巢癌中所占比例约为85%～90%[1-2]。目前，卵巢癌的发病机制仍不清楚，可能是多因子共同作用的结果, 有研究发现，趋化因子受体4(chemokine receptor type 4,CXCR4)在卵巢癌中高表达，可促进卵巢癌细胞增殖、侵袭和肿瘤血管生成；细胞周期蛋白D1(cell cycle protein D1,Cyclin D1)是细胞周期调节因子，可以促进肿瘤细胞的增殖、粘附、侵袭、转移和肿瘤血管生成，还能抑制肿瘤细胞的凋亡；表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)异常可导致卵巢出现恶变，而增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，Ki-67)被认为是一种增殖细胞核抗原，在多种恶性肿瘤中均有表达及过表达，且Cyclin D1及EGFR在EOC中的表达与临床分期及细胞分化程度有关[3-6]，本文应用免疫组织化学方法检测EOC 组织中CXCR4、、Cyclin D1、EGFR及Ki-67表达，探讨不同病理学参数下上述指标的变化及相关性，报告如下。

1　资料与方法

1.1临床资料与试剂

2008年2月～2012年12月经手术确诊的EOC患者40例，其中黏液性腺癌7例，浆液性腺癌33例，取其手术蜡块标本作为观察组，另选取同期手术的卵巢良性肿瘤10例为对照组，其中浆液性囊腺瘤3例，黏液性囊腺瘤7例。两组患者临床资料完整，术前未接受过放、化疗及免疫治疗，手术标本均送至病理科确诊。观察组16～83岁，平均(49.37±10.25)岁；组织学分级：低分化12例，中分化24例，高分化4例；FIGO(2009年)分期：Ⅰ期14例，Ⅱ期6例，Ⅲ期18例，Ⅳ期2例，7例有淋巴结转移；对照组17～69岁，平均(48.92±10.31)岁。兔抗人CXCR4多克隆抗体购自武汉博士德生物公司，兔抗人EGFR单克隆抗体购自上海基因公司， Cyclin D1兔抗人单克隆抗体、Ki-67鼠抗人单克隆抗体及SP免疫组化相关试剂盒均购自福州迈新生物技术有限公司。

1.2方法

采用SP免疫组织化学法，将选好的蜡块，3 μm连续切片，每例切4张，取其中一张做苏木素-伊红(HE)染色，其余做免疫组织化学染色。一抗工作浓度根据预实验结果调整，CXCR4为1∶150，Ki-67、Cyclin Dl及EGFR均为1∶100，对照组选用卵巢良性肿瘤。免疫组化染色程序严格按照试剂盒说明方法染色，所有切片染色均在相同条件下进行，每批染色均设阳性对照(试剂公司提供)和阴性对照(PBS代替一抗)。光学显微镜观察组织切片标本，两位病理科专家以双盲法认定结果。CXCR4、Cyclin D1、EGFR及Ki-67均以出现黄色或棕黄色颗粒为阳性细胞，CXCR4表达于细胞浆内；EGFR表达于细胞膜和胞浆，以包膜明显；Ki-67和Cyclin Dl均表达于细胞核内。结果判断：根据染色强度评分，无染色为0分，呈现淡黄色颗粒、明显高于背景为1分，呈现浅棕黄色颗粒为2分，出现大量深棕黄色颗粒为3分；根据阳性细胞数评分，每片随机观察5个视野，计数500个细胞中染色阳性细胞数，阳性细胞数<5%为0分，阳性细胞数5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。染色强度评分与阳性细胞数比例的评分相加之和<2为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为中度阳性(++)，6～7分为强阳性(+++)；弱阳、中阳、强阳均判为阳性，以中度阳性和强阳性为过表达。

1.3观察指标

比较CXCR4在对照组和EOC组的阳性表达率，分析CXCR4、Cyclin D1、EGFR及Ki-67在EOC患者癌组织中的阳性表达率与患者年龄、组织学分级、是否有淋巴转移及TNM临床分期的关系，采用Spearman秩相关分析EOC患者癌组织中CXCR4表达与EGFR、Cyclin D1及Ki-67表达的相关性。

1.4统计学方法

数据应用SPSS 16.0统计软件包统计，以率(%)表示，两样本率的比较采用四格表资料的χ2检验，不满足χ2检验条件时采用连续校正公式或FISH精确概率检验法。相关性采用Spearman秩相关分析，以相关系数(r)判断相关性，以P<0.05为有统计学意义。

2　结果

2.1CXCR4表达

CXCR4在对照组中呈阳性表达率为20%，观察组为57.50%，两组阳性表达率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2EOC癌组织中CXCR4、EGFR、Cyclin D1及Ki-67表达

EOC患者癌组织中的CXCR4的阳性表达率与EOC患者临床分期、组织学分级及有无淋巴转移有关(P<0.05)，与年龄无关(P>0.05)；EOC患者中Cyclin D1阳性表达率与临床分期、组织学分级有关(P<0.05)，而与年龄、有无淋巴结转移无关(P>0.05)；EGFR与Ki-67的过表达率与临床分期有关(P<0.05)，而与年龄、组织学分级及有无淋巴转移无关(P>0.05)。 见图1及表1。

注：A、B为Cyclin D1，C、D为Ki-67，E、F为CXCR4，G、H为EGFR；A、C、E、G为观察组中的强阳性表达，B、D、F、H为对照组中阴性表达图1　EOC患者癌组织中CXCR4、Cyclin D1、EGFR和Ki-67的表达(SP,×20)Fig.1　The expression of CXCR4, Cyclin D1, EGFR and Ki-67 in benign and malignant epithelial ovarian cancer

指标CXCR4阳性阳性(n)χ2PCyclinD1阳性阳性(n)χ2PEGFR过表达过表达(n)χ2PKi-67过表达过表达(n)χ2P年龄(岁) ≤45132.90.08142.351.30150.180.68140.100.85 >4510121615组织学分级 1+2128.20.01147.140.01200.980.32181.940.16 311121111淋巴转移 有74.30.0460.690.4171.150.2871.760.18 无16202422TNM分期 Ⅰ+Ⅱ612.30.0097.030.01125.160.02915.120.00 Ⅲ+Ⅳ17171920

2.3EOC患者癌组织中CXCR4表达与Cyclin D1、EGFR和Ki-67表达相关性

EOC患者癌组织中CXCR4的阳性表达与Cyclin D1的阳性表达、EGFR的过表达及Ki-67的过表达之间呈现正相关性(r=0.535、0.5060.490，P<0.05)。

3　讨论

EOC是妇科常见的恶性肿瘤，因其转移、复发致患者病情不能控制，死亡率高，5年生存率仅30%。目前认为细胞增殖失控和转移是EOC发生发展的基础。CXCR4在多种肿瘤细胞中均有表达，当与其配体CXCL12结合后形成CXCR4-CXCL12轴，此轴在肿瘤细胞的趋化及粘附、血管生成、侵袭和转移等方面发挥着至关重要的作用[2]。CXCR4在EOC中高表达，可促进EOC细胞增殖、侵袭和肿瘤血管生成[3]。 燕霞等[4]研究发现，CXCR4与淋巴结转移密切相关，认为CXCR4在促进淋巴转移过程中起着重要作用。本研究发现CXCR4在EOC中的表达显著高于卵巢良性肿瘤，差异有统计学意义(P<0.05)；在EOC中，CXCR4表达与临床分期、组织分级及淋巴转移有关，分期越晚，组织分级越高及有淋巴转移者CXCR4阳性表达越高。与刘静等[5]研究相符，提示：CXCR4在EOC形成、增殖、浸润及转移中有着重要作用。 Cyclin D1是细胞周期调节因子，可促进G1期向S期转化，加速细胞增殖，诱发肿瘤。其过表达可使EOC细胞增殖形成肿瘤。EGFR属于酪氨酸蛋白激酶，可以促进肿瘤细胞的增殖、粘附、侵袭、转移和肿瘤血管生成，还能抑制肿瘤细胞的凋亡[6]。大量研究显示：EGFR异常可导致卵巢出现恶变。Ki-67被认为是一种增殖细胞核抗原，在多种恶性肿瘤中均有表达及过表达。宋振飞等[7]研究发现：Cyclin D1及EGFR在EOC中的表达与临床分期及细胞分化程度有关 ，认为两者在EOC中过表达，并在一定程度上反映其恶性程度及预后状况。发现：EGFR和Ki-67表达在EOC的组织学分级、临床分期和有无淋巴结转移中具有统计学差异，认为两者在EOC的发生、发展中起着重要的作用 。本研究显示：Cyclin D1阳性表达率在临床分期、组织学分级方面差异具有统计学意义，而在年龄、淋巴结转移方面比较差异无统计学意义；EGFR与Ki-67的过表达率和临床分期有关，而与年龄、组织学分级及有无淋巴转移无关,与杨越等[8]研究结果部分相符，提示Cyclin D1、EGFR和Ki-67在EOC的形成和发展中起着重要作用，但本研究认为EGFR与Ki-67的过表达率仅与临床分期有关，与上述研究有差异，可能与样本量小以及判断标准不一致有关。有研究报道，CXCR4和EGFR有关联,两者相互作用可引起细胞内的ERK1/2和Akt通路启动从而引起EOC细胞的增殖[9]。而关于CXCR4与CyclinD1及Ki-67在EOC中表达的相关性未见报道。本研究结果显示，在EOC患者癌组织中CXCR4表达和CyclinD1、EGFR及Ki-67表达呈正相关性，可能机制为CyclinD1、EGFR及Ki-67上调CXCR4表达共同促进了EOC的增殖、浸润及淋巴转移。

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(2016-06-25收稿，2016-08-31修回)

中文编辑： 刘平； 英文编辑： 刘华

Expression and Significance of CXCR4 in Epithelial Ovarian Cancer

CHEN Guoqing1,2, WANG Xingxin2, ZI Dan1

(1.DepartmentofGynaecologyandObstetrics,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.DepartmentofGynaecologyandObstetrics,thePeople'sHospitalofWeiningCounty,Weining553100,Guizhou,China)

Objective: To investigate the expression of CXCR4, Cyclin D1, EGFR and Ki-67 in epithelial ovarian cancer (EOC) and its relationship with clinical pathological features. Methods: 40 cases of patients with epithelial ovarian cancer (observation group) and 10 cases of patients with ovarian benign tumor (control group) were tested for the expression of CXCR4, Cyclin D1, EGFR and Ki-67 protein by SP immunohistochemical assay kit. Combined with the medical record data, the relationship between the 4 cytokines and the clinical pathological characteristics was analyzed. Meanwhile, the relationship between CXCR4 and the other 3 cytokines was also analyzed. Results: The positive expression rate of CXCR4 in the observation group were significantly higher than those in the control group (P<0.05). There were statistically significant differences in the positive expression rate of CXCR4 under different pathology parameters such as clinical stage, histological grade and lymph node metastasis (P<0.05). There were statistically significant differences in the positive expression rate of Cyclin D1 under different pathology parameters such as clinical stage, histological grade and lymph node metastasis(P<0.05). The over expression rates of Ki-67 and EGFR was significantly related to clinical stage (P<0.05). CXCR4 were positively correlated with the expression of Cyclin D1, EGFR and Ki-67 in epithelial ovarian cancer(P<0.05). Conclusion: The joint detection of CXCR4, Cyclin D1, EGFR and Ki-67 may have important reference significance in prognosis of EOC and the choice of treatment of EOC.

ovarian tumor epithelial; chemokine receptor type 4; cell cycle protein D1; epidermal growth factor receptor; immunohistochemistry; staining method

贵州省科技厅联合基金[黔科合LG 字(2011) 032 号]

E-mail:2816497455@qq.com

R737.31

A

1000-2707(2016)09-1071-04

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.09.019

**贵州医科大学2015级同等学历硕士研究生，现工作于威宁县人民医院

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网络出版时间：2016-09-13网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160913.2240.014.html