苗药组方熏蒸疗法治疗家兔早期膝骨性关节炎*

王兴桂， 张力文， 王　政， 王贵春， 陈盼碧， 周汉华， 崔　瑾**

(1.贵阳中医学院, 贵州 贵阳　550025； 2.凯里市中医医院， 贵州 凯里　556000)



苗药组方熏蒸疗法治疗家兔早期膝骨性关节炎*

王兴桂1， 张力文1， 王政2， 王贵春2， 陈盼碧1， 周汉华1， 崔瑾1**

(1.贵阳中医学院, 贵州 贵阳550025； 2.凯里市中医医院， 贵州 凯里556000)

目的： 观察苗药熏蒸疗法对家兔早期膝骨性关节炎(KOA)的治疗效果。方法： 40只新西兰家兔随机分为A组(正常对照组)、B组(模型对照组)、C组(苗药熏蒸组)及D组(蒸馏水熏蒸组)，B、C、D组均采用木瓜蛋白酶注射法制造家兔早期KOA模型，A、B两组不予任何治疗，C、D两组在造模同时分别采用苗药组方和蒸馏水进行熏蒸治疗；实验结束时取各组家兔膝关节前正中矢状位股骨内髁内侧软骨标本制片，光镜扫描、电镜观察，采用Mankin’s法进行评分。结果： C组肉眼、光镜及电镜下软骨组织退变病理学改变较B、D组轻，但较A组重； Mankin’s评分显示，C组较B、D组低，较A组高(P<0.01)。结论： 苗药熏蒸疗法可以延缓KOA关节软骨的退变，对早期KOA具有较好的治疗作用。

苗药熏蒸疗法； 膝骨性关节炎； 家兔； 光镜； 电镜； 模型，动物

祖国传统医学认为膝骨性关节炎(knee osteoarthritis, KOA)属于“痹症”范围，其根本原因是因为风寒湿邪侵袭人体，导致血脉痹阻不通，气血运行受阻，或者是肝肾亏虚，经血不足，不能濡养筋骨而发病，病程相对较长，缠绵不愈。苗药熏蒸疗法治疗KOA具有缓解疼痛、协调关节运 动功能及延缓KOA发展等作用，苗药熏蒸疗法是我国少数民族地区普遍使用的外治疗法，它的治疗途径是经皮直接作用，药气从皮肤及黏膜渗入，可以避免药物经过胃肠道吸收的首过效应，从而降低了药物对人体的损害。苗药熏蒸利用毒性药物外治疾病是苗医药中独特的“以毒攻毒”方法。本研究通过在兔膝关节腔内注射木瓜蛋白酶复制早期KOA模型，选取长期实验及临床验证有效的苗药验方进行熏蒸治疗，观察苗药熏蒸对早期KOA的疗效，为苗医药治疗KOA提供理论及实验室依据。

1　材料与方法

1.1实验动物、主要试剂和仪器

3月龄新西兰兔40只，雌雄各半，体质量(0.50±0.10)kg，由重庆医科大学提供。饲养温度20～25 ℃，湿度50%～70%，光照节律6∶00～18∶00，雌雄隔离，饲常规颗粒饲料，自由饮水，动物房保持安静。木瓜蛋白酶(SIGMA公司产品)、4%多聚甲醛、10%水合氯醛。经贵阳中医学院药学院周汉华教授鉴定的贵州苗族熏蒸用药处方：透骨香30 g、艾纳香30 g、白龙须6 g、大血藤10 g、五香血藤10 g、土一枝蒿10 g、艾叶15 g等[1]。电子天平AR153O型(美国ohaus公司)、仿制汪元等[2]的动物熏蒸装置。

1.2方法

1.2.1分组、造模及治疗将40只新西兰兔随机分为A组(正常对照组)、B组(模型对照组)、C组(苗药熏蒸组)、D组(清水对照组)，每组10只。参照文献[2-3]的方法制造家兔KOA模型。在正常条件下喂养1个星期后，B、C、D组兔的右膝关节腔内注入1.6%木瓜蛋白酶生理盐水溶液0.5 mL，3 d后再注射第2次，一共2次。造模结束后，随机抽取2只家兔鉴定造模是否成功，主要通过肉眼观察、HE染色和改良Mankin’s评分[3-4]进行鉴定。C组在开始复制KOA模型的同时用8%～70%苗药液熏蒸治疗，将家兔放入到动物熏蒸装置中熏蒸右膝关节，于39～40 ℃，每次治疗10 min，连续治疗20 d；D组在相同条件下给予蒸馏水熏蒸患部，A组和B组不做熏蒸处理。

1.2.2检测指标于实验结束时处死家兔，取膝关节前正中矢状位股骨内髁内侧软骨，切片厚3 mm，4%多聚甲醛中固定。将置于多聚甲醛中的软骨组织染色。光学显微镜下按Mankin’s骨关节病病理组织分类方法进行评分；将取得的膝关节前正中矢状位股骨内髁内侧软骨标本；制成2 mm×1 mm切片，投入4 ℃的3%戊二醛酸溶液中固定，扫描电镜下观察、摄片。

1.3统计学处理方法

2　结果

2.1关节软骨外在形态观察

A组关节软骨为浅蓝白色，半透明状，表面很光滑，无裂纹及软化，无骨赘生成和滑膜增生，具有一定弹性，关节液比较清晰；B组关节软骨为灰黄色，色泽灰暗，表面粗糙，部分地方可有软骨下骨裸露，边缘有很多骨赘生成；关节液及滑液量较多且浑浊，关节囊及滑膜可见程度不等的增生、水肿；C组关节软骨呈淡白色，色泽暗淡，粗糙感不明显，软骨缺损不明显，还具有一定的弹性和透明状；关节液清晰，滑膜无增生；D组关节软骨呈淡黄色，表面粗糙，无光泽，透明程度和弹性均下降，边缘有骨赘生成；见图1。

2.2关节软骨光镜观察

A组见软骨表面光滑、整齐；厚度正常、结构、潮线清晰；软骨细胞正常，软骨陷窝分布正常，软骨基质染色正常，阿尔新蓝染色呈深蓝色；B组见软骨表面粗糙、凹陷；厚度相对正常，4层结构层次不清，表层纤维化，幅射层和深层软骨基质纤维松散，且可见脂肪沉积；表层软骨细胞数目较少，深层见软骨细胞增多且排列紊乱，无软骨陷窝及潮线；软骨基质染色少，阿尔新蓝染色见浅蓝色；C组见软骨表面稍粗糙；软骨厚度接近正常，4层结构层次清楚，软骨表层稍纤维化，幅射层和深层软骨基质纤维正常；软骨细胞数量正常，但排列稍紊乱，软骨陷窝正常；潮线清，结构完整；软骨基质染色稍少，阿尔新蓝染色呈蓝色；D组见，软骨表面粗、凹陷；软骨厚度变薄，4层结构层次稍紊乱，软骨表层纤维化，幅射层和深层软骨基质纤维松散；软骨基质染色轻度减少，阿尔新蓝染色呈淡蓝色；见图2。

空白对照组　　　　　　　　模型对照组　　　　　　　　苗药熏蒸组　　　　　　　　蒸馏水熏蒸组图1　4组家兔膝关节软骨标本Fig.1　Gross observation of rabbit knee cartilage in 4 groups

空白对照组　　　　　　　　模型对照组　　　　　　　　苗药熏蒸组　　　　　　　　蒸馏水熏蒸组图2　4组家兔膝关节软骨组织切片HE染色(400×)Fig.2　 The performance of rabbit knee cartilage under light microscope in 4 groups

空白对照组　　　　　　　　模型对照组　　　　　　　　苗药熏蒸组　　　　　　　　蒸馏水熏蒸组图3　4组家兔软骨组织切片阿尔新蓝染色(400×)Fig.3　The performance of rabbit knee cartilage under light microscope in 4 groups

2.3关节软骨电镜观察

A组软骨表面光滑平整，其胶原蛋白纤维呈条索状、相互交织成网。网状胶原纤维蛋白间有小间隙，呈多孔状，间隙均匀；B组软骨表面凹凸不平，其胶原网架结构紊乱，被大量条絮状物覆盖；较多的胶原纤维囊样变，多孔状结构模糊，间隙排列较乱；胶原蛋白纤维变粗、序列乱，形成虫蚀样变化；C组软骨的表面较平，胶原蛋白纤维呈条索状、相互交织成网，像正常软骨表面；但其表面条絮状物覆盖，其间的多孔状结构欠清；D组软骨表面欠平整，胶原网架结构乱，有大量条絮状物覆盖；胶原纤维出现囊样变，圆形突起增多；纤维之间的多孔状结构模糊，空隙排列紊乱，有的胶原蛋白纤维甚至呈虫蚀样改变；见图4。

空白对照组　　　　　　　　模型对照组　　　　　　　　苗药熏蒸组　　　　　　　　蒸馏水熏蒸组图4　4组家兔膝关节软骨电镜下表现(1 000×)Fig.4　The performance of rabbit knee cartilage under light microscope in 4 groups

2.4组织学Mankin’s评分

Mankin’s骨关节病病理组织分类评分结果显示，与A组比较，B、C、D组Mankin’s评分显著升高(P<0.01)；与B组比较，C组、D组评分降低(P<0.01)；与D组比较，C组评分降低(P<0.01)。

表1　各组家兔膝关节病理学Mankin’s评分

(1)与A照组比较，P<0.01；(2)与B组比较，P<0.01；(3)与C组比较，P<0.01

3　讨论

膝关节是人体最大的负重关节，外伤、过度活动等因素都可以引起KOA的发生，其病理特点为关节软骨的变性破坏、软骨下骨硬化或囊性病变、关节边缘骨质增生、滑膜增生、关节囊挛缩、韧带松弛或挛缩、肌肉萎缩无力等[5]。其负荷传递的紊乱导致关节软骨损伤、退变，从而使软骨细胞的代谢紊乱，因此发展为KOA[6]。KOA以膝关节退行性变为主要的病理改变，多见于老年人，是老年人腿痛的主要原因，肥胖、走路姿势的异常、长时间的受凉等也是导致KOA发生的重要因素，相关因素导致膝关节生物力学失衡就可以引起关节的应力变化，引起负荷传递的紊乱导致关节软骨损伤、退变，从而使软骨细胞的代谢紊乱，最终发展为KOA[7]。膝关节的韧带和软组织是保持其稳定性的重要结构，当关节软骨进一步损坏、骨赘形成时，关节周围的韧带、肌腱等软组织会产生粘连等退行性病变，从而导致膝关节自由活动受限，致使膝关节更加不稳，力学结构进一步发生改变，从而加重KOA病情[8-9]。苗医药熏蒸疗法作为祖国传统医学中的一种外治疗法，主要有药疗与热疗两方面的作用，可使药物直接到达病处，加强局部血液循环，达到防治疾病的目的。因其不经过胃肠道吸收可以有效的避免药物对胃肠道刺激而产生的副作用，而且直接作用于病变部位，尤其对痹症等风湿痹痛、皮肤疾病等病变有很好的疗效，因此被医学界誉为“绿色疗法”。

无论是原发性还是继发性的KOA，其关节损伤的病理都是由于内、外因素的作用引起软骨受损，软骨基质的分解和合成代谢失调造成软骨的破坏[8]，软骨发生代偿性增生，引起骨赘的形成。本次实验结果显示，与B组比较，C组软骨组织在肉眼、光镜、电镜下病理改变明显减轻，Mankin’s评分明显降低，其效果相比D组较明显，说明苗药熏蒸疗法可以延缓软骨的退变，对早期KOA具有较好的治疗作用。

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[3] 卫小春.关节软骨[M].北京:科学出版社, 2007:42.

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(2016-04-29收稿，2016-08-08修回)

中文编辑： 周凌； 英文编辑： 刘华

The Efficacy of Miao Medicine Fumigation Therapy in the Treatment of Rabbit with Early Knee Osteoarthritis

WANG Xinggui1, ZHANG Liwen1, WANG Zheng2, WANG Guichun2, CHEN Panbi1, ZHOU Hanhua1, CUI Jin1

(1.GuiyangMedicalcollegeofTCM,Guiyang550025,Guizhou,China; 2.KailiCityTCMHospital,Kaili556000,Guizhou,China)

Objective: To observe the efficacy of the Miao medicine fumigation therapy in the treatment of rabbit with early knee osteoarthritis (KOA). Method: 40 New Zealand rabbits were enrolled in this study, and randomly divided into group A(control group), group B(model control group), group C(Miao medicine fumigation group) and group D(water control group). The papain injections method was adopted to establish early KOA rabbit model in group B, group C and group D. Group A and group B received no treatment while group C and group D received Miao medicine fumigation and water fumigation, respectively. After treatment, the medial condylar cartilage samples were taken from the anterior median sagittal femoral medial condyle of the rabbits in each group, and light microscope, scanning electron microscope were used for observation and Mankin 's rating method was used to evaluate. Results: Compared with group B and group D, the cartilage tissue degeneration pathological changes in group C was less severe, but more severe compared with group A. Mankin's rating method showed that Mankin's score in group C was lower than that of group B and group D while higher than that of group A. Conclusion: Miao medicine fumigation therapy can delay the degeneration of articular cartilage of KOA, and has a better therapeutic effect on early KOA.

Miao medicine fumigation therapy; knee osteoarthritis; rabbit; light microscope; electron microscope; model,animal

国家自然基金项目(81260575)； 国家苗药工程技术研究中心项目(2014FU125Q09)

E-mail:516260179@qq.com

R29

A

1000-2707(2016)09-1025-04

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.09.008

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网络出版时间：2016-09-12网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.r.20160912.0924.002.html