扁蒴藤素对紫杉醇耐药乳腺癌细胞生长的抑制作用*

谢闺娥， 杜晶春， 董桂兰， 徐　霞**

(1.广州医科大学 金域检验学院， 广东 广州　510182； 2.广州大学 门诊部， 广东 广州　510006)



扁蒴藤素对紫杉醇耐药乳腺癌细胞生长的抑制作用*

网络出版时间：2016-09-13网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160913.2240.012.html

谢闺娥1， 杜晶春1， 董桂兰2， 徐霞1**

(1.广州医科大学 金域检验学院， 广东 广州510182； 2.广州大学 门诊部， 广东 广州510006)

目的： 研究扁蒴藤素对紫杉醇耐药乳腺癌细胞MCF-7/TAX生长的作用。方法： 以乳腺癌细胞株MCF-7为对照，同时制作紫杉醇耐药乳腺癌细胞MCF-7/TAX；在两组细胞中分别给与7种浓度(0.25、0.5、1、2.5、5、10和20 μmol/L)扁蒴藤素或紫杉醇培养48 h，用MTT法检测药物对MCF-7和MCF-7/TAX细胞作用的半数抑制浓度(IC50)值，并计算MCF-7/TAX细胞对紫杉醇或扁蒴藤素的耐药指数(RI)；同时用Annexin V-FITC/PI染色观察扁蒴藤素作用后MCF-7/TAX凋亡细胞比例。结果： MCF-7/TAX对紫杉醇RI达19.39，而扁蒴藤素对MCF-7/TAX细胞的生长有高效抑制作用，且呈现明显的剂量依赖性，对其作用48 h的IC50为0.52 μmol/L，MCF-7/TAX对扁蒴藤素的RI仅为0.88；扁蒴藤素作用后，Annexin V染色阳性的MCF-7/TAX细胞比例较对照明显升高。结论： 扁蒴藤素能抵抗紫杉醇耐药乳腺癌细胞的耐药性，激活MCF-7/TAX细胞凋亡，对其生长发挥高效抑制作用。

紫杉醇耐药； 扁蒴藤素； MCF-7/TAX； 凋亡

南蛇藤卫矛科南蛇藤属植物，在我国广泛分布。现已从南蛇藤中提取出大量萜类、生物碱、黄酮类化合物，三萜类化合物主要存在于南蛇藤的根皮中，研究表明，其中的扁蒴藤素(Pristimerin)具有广谱抗肿瘤、抗炎、抗氧化等多种药理活性[1-7]。紫杉醇广泛应用于包括乳腺癌在内的多种恶性肿瘤的治疗，然而肿瘤对紫杉醇的耐药性严重影响了治疗效果[8-9]。本文以紫杉醇耐药乳腺癌细胞株MCF-7/TAX为模型，研究扁蒴藤素对紫杉醇耐药乳腺癌细胞株MCF-7/TAX生长的作用，为探索抵抗紫杉醇耐药性的肿瘤高效化疗药物提供实验依据。

1　材料和方法

1.1主要材料与试剂

人乳腺癌MCF-7细胞系购自美国模式培养物保藏所(american type culture collection, ATCC)，MCF-7紫杉醇耐药细胞株(MCF-7/taxol-resistant, MCF-7/TAX)购自广州吉尼欧生物科技有限公司，扁蒴藤素、紫杉醇、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、碘化丙啶 (propidium iodide, PI)购自美国Sigma公司，胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)为美国Hyclone公司产品，DMEM培养基、胰蛋白酶、青霉素-链霉素混合溶液及Hepes为美国Gibco公司产品，MTT购自美国Genview公司，细胞培养板为美国Corning公司产品，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自美国Roche公司，其他试剂均为进口或国产分析纯试剂。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养MCF-7细胞培养于含10% FBS、100 000 IU/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM完全培养基中，紫杉醇耐药乳腺癌细胞MCF-7/TAX培养于含1.0 μmol/L紫杉醇的上述培养基中以维持其耐药表型；传代时用含0.02%EDTA的0.05%胰酶消化，以DMEM完全培养基终止消化。

1.2.2MTT比色法取传代培养24 h后增长迅速、处于对数生长期的细胞，用胰酶消化，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×107/L；每孔种200 μL细胞悬液于96孔培养板内，将培养板置37 ℃、5% CO2饱和湿度孵箱内培养；24 h后，取出培养板，吸去旧培养液，加入不同浓度的扁蒴藤素(设7个浓度：0.25、0.5、1、2.5、5、10和20 μmol/L)或不同浓度的紫杉醇(设7个浓度：0.25、0.5、1、2.5、5、10和20 μmol/L)，同时设立对照组，每组均设3个平行孔，置37 ℃、5% CO2饱和湿度孵箱内培养；48 h后取出96孔板，在超净工作台内每孔加MTT(5 g/L)20 μL，培养箱内继续培养4 h；取出培养板，在倒置相差显微镜下观察细胞内MTT与线粒体酶反应后生成的蓝紫色结晶物；用注射器小心吸弃培养基，加入100 μL DMSO置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解；用酶联免疫检测仪在570 nm波长处测定其吸光度(OD)值，计算生长抑制率：抑制率%=[(1-OD加药组)/OD对照组]×100%，并参照文献[9]用Bliss’s软件计算半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50)值。耐药指数(resistance index，RI)=耐药细胞IC50/亲本细胞IC50。

1.2.3Annexin V-FITC/PI染色取对数生长期的人乳腺癌细胞MCF-7/TAX接种于培养皿内，置37 ℃、5% CO2孵箱中培养过夜；加入终浓度为1.0 μmol/L的扁蒴藤素，8 h后用不含EDTA的胰蛋白酶将细胞从培养皿消化下来，制成单细胞悬液，PBS洗涤细胞2次；用1×binding buffer悬浮细胞至1×109个/L，取100 μL细胞悬液加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI，混匀，室温避光反应15 min；然后再加入400 μL 1×binding buffer充分混合后在流式细胞仪上检测细胞凋亡情况。

1.3统计学方法

2　结果

2.1MCF-7/TAX对紫杉醇的耐药情况

MTT结果显示(图1A)，紫杉醇对MCF-7作用48 h的 IC50为1.07 μmol/L，对紫杉醇耐药细胞株MCF-7/TAX作用48 h的 IC50为20.75 μmol/L，RI达19.39(表1)。

2.2扁蒴藤素对MCF-7/TAX的生长抑制情况

MTT结果显示(图1B)，扁蒴藤素能抑制紫杉醇耐药细胞MCF-7/TAX的生长，且具有明显的剂量依赖性，作用48 h的 IC50仅为0.52 μmol/L，对MCF-7作用48 h的 IC50为0.59 μmol/L，MCF-7/TAX对扁蒴藤素的RI仅为0.88(表1)。

表1　扁蒴藤素及紫杉醇对MCF-7/TAX和MCF-7细胞的IC50及RI

2.3扁蒴藤素诱导MCF-7/TAX细胞凋亡

Annexin V-FITC/PI双染法结果显示，MCF-7/TAX不加扁蒴藤素的细胞凋亡率为0.8%，加1.0 μmol/L扁蒴藤素作用8 h后的细胞凋亡率达28.9%，凋亡细胞的比例明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

3　讨论

肿瘤细胞对多种化学药物产生交叉耐药性，称多药耐药(multidrug resistance，MDR)，是造成肿瘤化疗失败的主要原因[10]。由于传统的抗癌药在化疗过程中都往往会导致多药耐药的产生，因此开发一些新的能够对多药耐药的肿瘤细胞也敏感的抗癌药物是当务之急。扁蒴藤素是雷公藤红素的甲酯衍生物，主要存在于卫矛科和希藤科植物中。随着研究范围不断扩大，扁蒴藤素的多种药理活性逐渐被人们关注和研究，研究表明扁蒴藤素具有抗炎、抗氧化等多种药理活性，并具有广谱抗肿瘤作用[1-7]。据报道，给药6 h后，3 μmol/L的扁蒴藤素可抑制81%人乳腺癌细胞MDA-MB-231的生长[11]。但有关于扁蒴藤素研究的报道还很有限，其对紫杉醇耐药乳腺癌细胞的作用尚未明确。

注：A为紫杉醇，B为扁蒴藤素；(1)与MCF-7/TAX+紫杉醇比较，P<0.05图1　MCF-7/TAX细胞对紫杉醇和扁蒴藤素耐药情况(MTT法)Fig.1　The resistance situation of MCF-7/TAX cells to paclitaxel by MTT assay

注：A为对照，B为1.0 μmol/L扁蒴藤素；横坐标为Annexin-V，纵坐标为PI图2　扁蒴藤素对MCF-7/TAX细胞凋亡的影响(Annexin V-FITC/PI)Fig.2　Effect of pristimerin on apoptosis of MCF-7/TAX cells (Annexin V-FITC/PI staining)

本文对扁蒴藤素对紫杉醇耐药细胞株MCF-7/TAX生长的影响进行了探讨。MTT比色结果显示，紫杉醇耐药细胞株MCF-7/TAX对紫杉醇的耐药指数达19.39；而扁蒴藤素作用MCF-7/TAX细胞48 hr的IC50仅为0.52 μmol/L，降低其耐药指数至0.88，说明扁蒴藤素能抵抗紫杉醇耐药乳腺癌细胞的耐药性，对其生长发挥高效抑制作用。凋亡是一种生理性、程序性的细胞死亡过程，细胞凋亡异常是肿瘤发生与发展的关键因素之一。MDR产生的机制非常复杂，研究表明凋亡逃逸(细胞抗凋亡能力提高)也是其重要机制之一。激发和恢复肿瘤细胞发生凋亡的能力，是肿瘤防治的有效途径[12]。本研究Annexin V-FITC/PI染色结果表明，经扁蒴藤素作用后，Annexin V-FITC染色阳性的MCF-7/TAX细胞比例升高，表明扁蒴藤素能诱导紫杉醇耐药MCF-7/TAX细胞凋亡的发生。

本研究结果证实，扁蒴藤素能抵抗紫杉醇耐药乳腺癌细胞的耐药性，激活MCF-7/TAX细胞凋亡，从而对其生长发挥高效抑制作用，这将为开发治疗紫杉醇耐药的新药提供实验依据。

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(2016-03-25收稿，2016-07-31修回)

中文编辑： 刘平； 英文编辑： 刘华

Inhibitory Effect of Pristimerin on Growth of Taxol-Resistant Breast Cancer Cells

XIE Guie1, DU Jingchun1, DONG Guilan2, XU Xia1

(1.KingmedSchoolofLaboratoryMedicine,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510182,Guangdong,China; 2.OutpatientDepartment,GuangzhouUniversity,Guangzhou510006,Guangdong,China)

Objective: To investigate the effect of pristimerin on the growth of taxol-resistant breast cancer cells MCF-7/TAX. Methods: The breast cancer cell line MCF-7 was the control group, and the taxol-resistant breast cancer cells line MCF-7/TAX was the observation group. In two groups of cells were cultured in 7 kinds of concentrations (0.25, 0.5, 1, 2.5, 5, 10 and 20 mol/L) pristimerin and paclitaxel for 48 h. MTT assay was used to detect half inhibition concentration (IC50) value of drug on MCF-7 and MCF-7/tax cells, and resistance index (RI) of cells to paclitaxel or pristimerin were calculated. At the same time Annexin V-FITC/PI staining was adopted to observe changes of proportion of apoptotic cells after pristimerin involvement. Results: The resistance index of MCF-7/TAX cells to paclitaxel was 19.39. After treatment with pristimerin for 48 h, MCF-7/TAX cells displayed markedly growth inhibition in a dose-dependent manner, and IC50 for 48 h was 0.52 μM. The resistance index of MCF-7/TAX cells to pristimerin was 0.88. After treatment with pristimerin, the proportion of positive MCF-7/TAX cells of Annexin V-FITC/PI staining was significantly higher than that of the control group. Conclusion: Pristimerin can resist resistance to paclitaxel resistance to breast cancer cells, activate apoptosis of MCF-7/TAX cells, thus effectively inhibit cancer cells growth.

taxol resistance; pristimerin; MCF-7/TAX; apoptosis

国家自然科学基金(81101682)； 广东省公益研究与能力建设专项资金(2014A020212015)

R285

A

1000-2707(2016)09-1029-04

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.09.009

**通信作者 E-mail:xux2014@126.com