microRNA-29c过表达对人胰腺癌AsPC-1、PANC-1细胞增殖的影响*

周显飞， 田　舍， 王　杰， 贾亮亮， 喻　超， 江建新

(贵州医科大学附院 肝胆外科， 贵州 贵阳　550004)



microRNA-29c过表达对人胰腺癌AsPC-1、PANC-1细胞增殖的影响*

周显飞， 田舍， 王杰， 贾亮亮， 喻超， 江建新**

(贵州医科大学附院 肝胆外科， 贵州 贵阳550004)

目的： 探讨microRNA-29c过表达对人胰腺癌AsPC-1、PANC-1细胞增殖的影响。方法： 构建含microRNA-29c过表达腺病毒并感染至胰腺癌AsPC-1及PANC-1细胞(实验组)，感染空载体作为阴性对照组，采用实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测AsPC-1和PANC-1感染microRNA-29c 24 h时的感染效率， CCK-8实验检测microRNA-29c感染48 h时人胰腺癌细胞的增殖能力，细胞平板克隆实验检测感染microRNA-29c 24 h人胰腺癌细胞的单克隆形成能力。结果: 与阴性对照组比较， microRNA-29c感染AsPC-1及PANC-1细胞后microRNA-29c表达水平明显升高；过表达microRNA-29c后AsPC-1和PANC-1细胞增殖能力明显受到抑制，细胞的克隆形成数明显减少(P<0.01)。结论： microRNA-29c 过表达能有效抑制胰腺癌细胞的增殖能力，有望成为治疗胰腺癌的新靶标。

微小RNA； microRNA-29c； 胰腺癌； 细胞增殖； 腺病毒

胰腺癌是恶性程度最高、预后最差的实体瘤之一，具有极为恶性的生物学特征，其发生发展过程受到多种编码基因与非编码基因的调控[1]。尽管目前胰腺癌的诊断和治疗技术有了很大的进展，但其5年生存率仍然很低[1]。microRNA是一类非编码小分子RNA，成熟的microRNA是由发夹状双链RNA经RNase III Dicer剪切而来，至少30%的人类基因受到microRNA的调控[2-3]。microRNA可与靶mRNA 互补结合，从而抑制靶mRNA翻译和促进mRNA降解[4-5]； microRNA还参与细胞的增殖与死亡、分化、发育、细胞增殖及凋亡等一系列生物学过程，甚至与肿瘤的发生、发展密切相关[6-8]。microRNA-29家族包括microRNA-29a/b/c, microRNA-29c位于第1号染色体，是该家族主要成员。有研究发现，在胰腺癌组织和细胞中microRNA-29c表达降低，并参与胰腺癌的发生发展过程[9]，但关于 microRNA-29c在胰腺癌中的具体生物学功能及作用机制未见报道。因此，进一步了解及完善胰腺癌的发病机制对于胰腺癌的早期发现、诊断及治疗尤为重要。本研究通过microRNA-29c过表达腺病毒分别感染胰腺癌AsPC-1及PANC-1细胞，观察microRNA-29c对人胰腺癌细胞增殖的影响。

1　材料与方法

1.1细胞株及主要试剂

人胰腺癌细胞AsPC-1及PANC-1获赠于华中科技大学附属同济医院胆胰外科实验室，进口胎牛血清、RPMI、DMEM 及RPMI 1640细胞培养基、0.05%含EDTA 的胰蛋白酶均购自gibico公司，CCK-8 检测试剂盒购自碧云天公司，RNA抽提试剂Trizol购自Invitrogen公司，microRNA-29c 腺病毒过表达载体的构建、腺病毒包装与滴度检测由山东维真生物科技有限公司完成，逆转录试剂盒、SYBR Premix ExTaq 试剂盒均购自TaKaRa 公司，pre-microRNA-29c的逆转录及real-time PCR 引物套装购自广州锐博公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养AsPC-1用含10%胎牛血清的RPMI1640 培养基， PANC-1用含10% 胎牛血清的RPMI DMEM培养基，两组细胞均置于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养。

1.2.2microRNA-29c腺病毒感染胰腺癌细胞及感染效率检测将AsPC-1及PANC-1细胞分别分为microRNA-29c感染组(实验组)和空载体组(阴性对照组)。根据腺病毒操作手册查得胰腺癌细胞AsPC-1及PANC-1的MOI值，取2×105个对数生长期AsPC-1及PANC-1细胞分别接种于6孔板中，待细胞贴壁后根据慢病毒感染复数(MOI)值在实验组AsPC-1及PANC-1细胞中加入适量的microRNA-29c腺病毒液，阴性对照组加入同等量的空载体，培养箱中培养12 h时换液，再培养12 h时用TRIzol试剂盒根据操作说明分别提取实验组和阴性对照组中AsPC-1及PANC-1中的总RNA，测定总RNA浓度；采用实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测AsPC-1及PANC-1中microRNA-29c的表达，microRNA-29c、内参U6逆转录引物和RT-qPCR相关上下游引物由广州锐博生物有限公司设计合成后提供，各组相对表达量采用2-△△Ct法计算。

1.2.3检测细胞增殖采用CCK-8法，感染腺病毒48 h时收集AsPC-1及PANC-1细胞，以3× 103个/孔细胞接种于96 孔板中，每组分别设24、48及72 h 组，每个时间点设置3 个复孔；检测前每孔分别加入CCK-8 试剂10 μL ，避光37 ℃孵育2 h，轻轻振荡后，酶标仪 450 nm 波长处测定光密度(OD)值，观察microRNA-29c对胰腺癌细胞增殖的影响。

1.2.4人胰腺癌细胞单克隆形成能力采用细胞平板克隆实验，感染腺病毒24 h后收集AsPC-1及PANC-1细胞，以1×103个/孔细胞接种于6孔板中，每组设置3个复孔，连续5 d观察细胞状态；细胞经4%多聚甲醛固定30 min，1%结晶紫染色30 min；PBS洗3遍后干燥处理。数字拍摄成像，于显微镜下计数>10个细胞的克隆数，计算克隆形成率(%)=(克隆数/接种细胞数)×100%。

1.3统计学处理

2　结果

2.1microRNA-29c表达

microRNA-29c腺病毒感染AsPC-1及PANC-1后，AsPC-1及PANC-1实验组中microRNA-29c表达都明显增加，相对表达量分别为(1.004±0.234)、(1.122±0.220)；阴性对照组为(0.414±0.084)、(0.436±0.065)，两种细胞的实验组及阴性对照组microRNA-29c相对表达量比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。

(1)与同细胞阴性对照组比较，P<0.05图1　感染microRNA-29c腺病毒后AsPC-1与PANC-1细胞内microRNA-29c的表达Fig.1　MiR-29c adenovirus increased expression of miR-29c in AsPC-1 and PANC-1 cells

2.2胰腺癌细胞的增殖能力

胰腺癌细胞AsPC-1及PANC-1感染microRNA-29c 48 h时， CCK8法结果显示，与阴性对照组比较，实验组AsPC-1及PANC-1细胞的增殖能力均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。表明上调microRNA-29c在胰腺癌细胞系中的表达可显著抑制胰腺癌细胞的增殖能力。

2.3microRNA-29c过表达对胰腺癌细胞克隆形成能力的影响

细胞平板克隆实验结果显示(图3)，实验组AsPC-1及PANC-1克隆形成率分别为(1.38±0.023)、(0.8±0.059)；阴性对照组为(2.96±0.065)、(2.4±0.046)，两组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)；提示microRNA-29c过表达的两种胰腺癌细胞的克隆形成能力明显受到抑制。

注：A为AsPC-1细胞，B为PANC-1细胞；(1)与同细胞阴性对照组比较，P<0.05图2　感染microRNA-29c腺病毒后AsPC-1与PANC-1细胞的增殖能力Fig.2　Over-expression of microRNA-29c inhibited PANC-1 and AsPC-1 cells proliferation ability

注：A为PANC-1细胞，B为AsPC-1细胞；(1)与同细胞阴性对照组比较，P<0.05图3　胰腺癌细胞PANC-1与AsPC-1的克隆形成能力Fig.3　Over-expression of microRNA-29c inhibited AsPC-1 and PANC-1 cells colony formation ability

3　讨论

microRNA是一类长度约为21个碱基的非编码小分子RNA，成熟的microRNA是由60～80个碱基的发夹状双链RNA经RNase Ⅲ Dicer酶剪切而来，至少30%的人类基因受到microRNA的调控[2-3]。大量研究表明microRNA在生物体内起到致癌或者抑癌作用，是通过调控致癌和抑癌基因的表达来实现的；在胰腺癌中，胰腺癌细胞的增殖和生存就受到其调控，研究发现，microRNA-34a在胰腺癌组织中的表达明显低于正常胰腺组织，microRNA-34a通过影响胰腺癌细胞的细胞周期、DNA修复及凋亡从而起到抑制肿瘤细胞的增殖作用[10]；同样也有研究表明microRNA-34b在胰腺癌组织中较癌旁组织明显下调，过表达microRNA-34b可抑制胰腺癌细胞的增殖能力[11]。而在对microRNA-27a和microRNA-96的研究时发现，它们在胰腺癌组织和细胞中表达明显升高，抑制其表达可明显抑制胰腺癌细胞的增殖，迁移和凋亡，是致癌的microRNA[12-13]。本研究通过microRNA-29c过表达腺病毒分别感染胰腺癌AsPC-1及PANC-1细胞，观察microRNA-29c对人胰腺癌细胞增殖的影响。实验结果表明，感染microRNA-29c腺病毒的胰腺癌AsPC-1及PANC-1细胞中microRNA-29c的表达明显增强；进一步的CCK-8细胞增殖实验结果显示microRNA-29c过表达后的人胰腺癌细胞株AsPC-1及PANC-1增殖速率明显较阴性对照组下降；细胞平板克隆实验也证实了过表达microRNA-29c后胰腺癌AsPC-1及PANC-1细胞的单克隆增殖能力明显减弱，说明上调microRNA-29c在胰腺癌细胞系中的表达可显著抑制胰腺癌细胞的增殖能力，细胞克隆的形成能力也明显受到抑制。

综上，microRNA-29c作为新发现的抑癌microRNA分子，也可有效抑制胰腺癌AsPC-1及PANC-1细胞的生长，可能成为胰腺癌的治疗新靶标。为后续探讨microRNA-29c参与胰腺癌生物学行为的分子机制提供指导，也为胰腺癌的分子靶向治疗提供新的策略。

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(2016-05-28收稿，2016-08-25修回)

中文编辑： 吴昌学； 英文编辑： 赵毅

Effect of microRNA-29c Over-expression on Proliferation of Human Pancreatic Cancer Cells

ZHOU Xianfei, TIAN She, WANG Jie, JIA Liangliang, YU Chao, JIANG Jianxin

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To investigate the effect of miR-29c over-expression on the proliferation of human pancreatic cancer cells, AsPC-1、PANC-1. Methods: The recombination adenovirus Ad-miR-29c and control adenovirus was constructed and transfected human pancreatic cancer cells, AsPC-1 and PANC-1 cell (experiment group). The expressions of miR-29c in AsPC-1 and PANC-1 cells were detected by real-time PCR. The CCK-8 assay was applied to examine the proliferation ability of miR-29c on the proliferation of human pancreatic cancer cell. The cell colony formation assay was used to measure the growth of the cells after infected by miR-29c for 24 h. Results: After infected with Ad-miR-29c and PANC-1, the miR-29c expression levels increased；the over-expression of microRNA-29c in the pancreatic cancer cells significantly inhibited the proliferation abilities of AsPC-1 and PANC-1 cells, cell clone formation abilities were also significantly decreased (P<0.01). Conclusion: miR-29c can effectively suppress the proliferation of human pancreatic cancer cells，which makes a promising new therapeutic target for pancreatic cancer．

micro RNA; miR-29c; pancreatic cancer; cell proliferation；adenovirus

国家国际科技合作专项资助(2014DFA31420); 国家自然科学基金资助项目(81160311)

E-mail:jjx731003@163.com

R735.9

A

1000-2707(2016)09-1002-04

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.09.003

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网络出版时间：2016-09-13网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160913.2240.016.html