叉头框C2蛋白在肾细胞癌组织中的表达及临床意义

杜　昆　杨继宏　黄淑红.华北石油管理局总医院泌尿外科，河北任丘　06550；.山东大学医学院，山东济南　500

叉头框C2蛋白在肾细胞癌组织中的表达及临床意义

杜昆1杨继宏1黄淑红2
1.华北石油管理局总医院泌尿外科，河北任丘062550；2.山东大学医学院，山东济南250012

目的 研究叉头框C2蛋白 （FOXC2）在肾细胞癌组织及癌旁组织中的表达差异及临床意义。方法 收集2013年3月～2016年1月华北石油管理局总医院40例肾细胞癌患者术后肾细胞癌组织及癌旁组织，采用qRTPCR、免疫组织化学染色及Western blot方法检测各组织中FOXC2的表达水平，分析FOXC2的表达与肾细胞癌临床病理的关系。 结果 qRT-PCR结果显示，FOXC2 mRNA在肾细胞癌组织中表达较癌旁组织明显降低 （P＜0.05）；免疫组化结果和Western blot结果显示，肾细胞癌组织中FOXC2蛋白表达较癌旁组织明显下调 （P＜0.05）。FOXC2在肾细胞癌组织中的低表达与患者的性别、年龄、肿瘤直径、有无包膜、病理分期无关（P＞0.05），但与肾细胞癌的病理分型有关（P＜0.05）。结论 FOXC2在肾细胞癌组织中异常低表达，可能与肾细胞癌的发生发展相关，可以作为肾细胞癌潜在的分子靶点进行研究。

肾细胞癌；叉头框C2；基因表达；表达下调

［Abstract］Objective To analyze the difference of the expression of FOXC2 between renal cell carcinoma and its adjacent tissues and its clinical significance.Methods Forty renal cell carcinoma tissues and adjacent tissues of patients with renal cell carcinoma from May 2013 to January 2015 from in General Hospital of North China Petroleum Administration Bureau were collected.The expression of FOXC2 mRNA was detected by qRT-PCR，FOXC2 protein was detected by immunohistochemistry and Western blot in renal cell carcinoma tissues and adjacent tissues.The relationship between the expression of FOXC2 and clinical pathology of patients with renal cell carcinoma were analyzed.Results Results of qRT-PCR showed that，the expression of FOXC2 mRNA in renal cell carcinoma tissues was significantly lower than that of the adjacent tissues（P＜0.05）；results of immunohistochemistry and Western blot showed that，the expression of FOXC2 protein was down-regulated，compared with that of the adjacent tissues（P＜0.05）.The low expression of FOXC2 in renal cell carcinoma tissue was not related to gender，age，tumor size，pathological stages and envelope（P＞0.05），but related to pathological types（P＜0.05）.Conclusion The abnormal low expression of FOXC2 may be related to renal cell carcinoma，and can be used as a potential molecular target for renal cell carcinoma.

［Key words］Renal cell carcinoma；FOXC2；Gene expression；Down-regulated

肾细胞癌（Renal cell caecinoma，RCC）是成年肾脏疾病中最常见的恶性肿瘤，近年来国内外发病率在不断上升［1］。研究发现叉头框C2（Forkhead box C2，FOXC2）蛋白在肿瘤的发生发展和侵袭转移过程中发挥重要作用。研究证明FOXC2在乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌等多种肿瘤的原发性浸润和继发性转移中发挥关键调控作用［2］。但目前尚未有FOXC2蛋白与肾细胞癌的相关研究，本文通过分析肾细胞癌中FOXC2的表达，进一步探讨FOXC2与肾细胞癌的发生发展及侵袭是否相关。

1　对象与方法

1.1对象

1.1.1组织标本组织标本均来源于 2013年3月～2016年1月华北石油管理局总医院住院的手术患者，经术后病理检查诊断为肾细胞癌，收集肾细胞癌标本40例及其癌旁组织40例作为对照。所有病例术前均未进行放、化疗，均有详细的临床资料及手术记录。标本用10%中性甲醛进行固定，常规石蜡包埋，4 μm连续切片，保存切片。

1.1.2主要试剂鼠抗人FOXC2单克隆抗体购自Abcam公司；鼠抗人β-tubulin单克隆抗体购自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR抽提总RNA，反转录为cDNA，以各组cDNA为模板，进行qRT-PCR。FOXC2上游引物：5'-GCAGTTACTGGACCCTGGAC-3'，下游引物：5'-CTTCTTCTCGGCCTCCTTGG-3'；内参GAPDH上游引物：5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3'，下游引物：5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'。反应体系：模板2 μL，2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ10 μL，引物0.8 μL+0.8 μL，ddH2O 6.4 μL。反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性15 s，60℃退火延伸30 s，72℃后延伸7 min，共40个循环。使用2-ΔΔCt分析法进行数据分析。实验独立重复3次。

1.2.2免疫组织化学染色所有石蜡标本60℃烘烤2 h，采用EnVision二步法进行免疫组化染色，染色步骤按试剂盒说明书进行。以PBS作为阴性对照，同时设空白对照，已知阳性片作阳性对照。

1.2.3Western blot检测取新鲜组织提取蛋白，BCA法测浓度。取50 μg蛋白进行电泳，SDS-PAGE电泳后电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，加一抗（1∶1000），4℃孵育过夜，加二抗（1∶5000），孵育1 h，ECL化学发光法显色。采用Image J分析图像，以FOXC2/β-tubulin灰度比值表示FOXC2蛋白相对表达水平。

1.2.4结果半定量分析在光学显微镜40×10视野下，每个样本选取5个视野，采用Barnes法统计分析，按以下标准进行计分：显色细胞的比例：0（0%）；1（1%～10%）；2（＞10%～50%）；3（＞50%～80%）；4（＞80%）。其中0表示为阴性；1～3为弱阳性；4为强阳性。

1.3统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1FOXC2 mRNA相对表达量的检测

qRT-PCR结果显示：FOXC2在肾细胞癌中相对表达量为（0.0974±0.0316），癌旁组织中相对表达量为（0.3582±0.0128），两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1　FOXC2 mRNA在肾细胞癌及癌旁组织中的相对表达量

2.2FOXC2蛋白的免疫组化检测

免疫组化染色结果显示：FOXC2蛋白在肾细胞癌细胞中阳性表达率为70%（28/40），不同的病理分型中阳性表达率不同，在嫌色性肾细胞癌和Bellini集合管癌组织中阳性表达率为100%，而在肾母细胞瘤中仅为20%，见表1。肾肿瘤细胞着色较浅（图2A～G），而癌旁组织细胞着色较深（图2H～I），提示FOXC2在肾细胞癌中表达下调。

图2　FOXC2在肾细胞癌和癌旁组织中的表达（免疫组织化，100×）

表1　不同肾脏组织中FOXC2蛋白的表达情况

2.3Western blot检测FOXC2在肾细胞癌及癌旁组织中的表达

每种病理亚型选取2例样本对FOXC2的蛋白表达进行Western blot分析，结果显示，FOXC2蛋白在癌旁组织中表达较高（0.5724±0.0144），在肾细胞癌组织中表达较低（0.2300±0.0671），差异有统计学意义（P＜0.05），与免疫组化结果一致，见图3。提示FOXC2在肾细胞癌组织中表达下调。

图3　FOXC2在肾细胞癌及癌旁组织中表达的Western blot分析

2.4FOXC2的表达水平与肾细胞癌临床病理参数的关系

40例肾细胞癌肿瘤组织中FOXC2表达下调率为50%（20/40）。经统计学分析，FOXC2的表达水平与患者的年龄、性别、肿瘤直径、TNM分期、有无包膜无关（P＞0.05），但与病理分型有关（P＜0.05）。见表2。

3　讨论

FOXC2属于FOXC亚族，是forkhead转录因子家族重要成员之一。FOXC2参与调控血管、淋巴管的生成［3］，调控骨骼和主动脉弓的发育，与多种代谢性疾病密切相关［4］。近年来研究发现，FOXC2与肿瘤的浸润和远处转移密切相关，在卵巢癌和胶质母细胞瘤中过表达的FOXC2促进了卵巢癌细胞的侵袭［5］、胶质母细胞瘤细胞的增殖和侵袭［6］；FOXC2的阳性表达与子宫颈癌细胞增殖和侵袭能力有关［7-8］；FOXC2的表达还与鼻咽癌、原发性肝细胞癌、结直肠癌的侵袭转移密切相关［9-12］。

目前普遍认为，FOXC2主要是通过参与上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）过程及肿瘤血管的生成过程，调控肿瘤发生发展及浸润转移［13］。FOXC2可以促进肿瘤细胞发生EMT，对EMT起着关键的调节作用［14-15］，在胃癌中，FOXC2通过促进EMT的发生影响其发展及转移［16］。研究表明，FOXC2的突变导致血管内皮生长因子受体-A（vascular endotheliar growth factor-A，VEGF-A）表达下调［17］，VEGR-A的表达下调通过对Raf/MEK/Erk、PI3K/Akt等信号通路的调控限制肿瘤的血管生成，引起血管内皮细胞凋亡；在结直肠癌中，FOXC2基因是通过激活MAPK和Akt途径促进细胞增殖［12］。FOXC2可以通过调节血小板衍生生长因子-β的水平来调控PDGF信号通路，进而调节肿瘤血管的生成及生存［17］。除此之外，FOXC2还可以调控肿瘤相关成纤维细胞的数量来影响肿瘤血管的生成。有研究表明，肾缺血/再灌注损伤后的低氧条件能诱导FOXC2表达上调，在肿瘤中能诱导血管生成［18］。已知75%～85%的肾细胞癌是高度血管化的肿瘤，肾细胞癌发展转移与很多促进血管生成的生长因子受体过度表达或活化有很大的关系［19］。但目前尚无FOXC2蛋白在肾细胞癌中发挥作用的相关报道。

表2　FOXC2的表达与肾细胞癌患者临床病理参数之间的关系

本研究表明FOXC2在肾细胞癌肿瘤中阳性表达，与癌旁组织相比表达明显下调（P＜0.05）；FOXC2蛋白的下调表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期及有无包膜无关，但与病理分型相关（P＜0.05）。因此，FOXC2蛋白在肾细胞癌中表达下调，可能参与了肾细胞瘤的发生发展。大多数研究表明，FOXC2在其他肿瘤中大多为上调表达，但在肾细胞癌中出现了下调表达的情况。因此，FOXC2蛋白在肾细胞癌中可能除了以上的机制外还存在新的调控机制，还需要继续深入地研究。

综上所述，肾细胞癌肿瘤中FOXC2基因出现异常低表达的情况，FOXC2基因可能参与了肾细胞癌的发生发展，为肾细胞癌的分子诊疗提供了新的思路。

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Expression of FOXC2 and its clinical significance in renal cell carcinoma tissues

DU Kun1YANG Jihong1HUANG Shuhong2
1.Department of Urology Surgery，General Hospital of North China Petroleum Administration Bureau，Hebei Province，Renqiu062550，China；2.Medical Academy of Shandong University，Shandong Province，Ji'nan250012，China

R737.11

A

1673-7210（2016）08（b）-0118-04

2016-05-04本文编辑：任念）