核因子-κB在慢性髓细胞白血病急变期前后的变化

艾克拜尔·阿布都热衣木　徐　丽　阿依姆妮萨·阿卜杜热合曼　海热萨·阿布力米提　刘加军.新疆维吾尔自治区喀什地区第一人民医院血液科，新疆喀什　844000；2.中山大学血液病研究所，广东广州　50630

核因子-κB在慢性髓细胞白血病急变期前后的变化

艾克拜尔·阿布都热衣木1徐丽1阿依姆妮萨·阿卜杜热合曼1海热萨·阿布力米提1刘加军2▲
1.新疆维吾尔自治区喀什地区第一人民医院血液科，新疆喀什844000；2.中山大学血液病研究所，广东广州510630

目的 探讨核因子-κB（NF-κB）在慢性髓细胞白血病（CML）急变期前后的表达及意义。方法 选择2011年2月～2013年2月于新疆喀什人民医院血液科住院治疗的25例慢性髓细胞白血病慢性期 （CML-CP）（CML-CP组）、16例慢性髓细胞白血病急变期（CML-BC）患者（CML-BC组）、30例缺铁性贫血或巨幼细胞性贫血患者（对照组）为研究对象。采用凝胶迁移或电泳迁移率实验检测三组人骨髓细胞中NF-κB的表达。结果 对照组患者的NF-κB活性测定均为阴性，CML-CP组也仅4例患者检测到NF-κB活性增强，CML-BC组14例患者的NF-κB活性增强。CML-BC组患者NF-κB活化率明显高于CML-CP组及对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；CML-CP组活化率高于对照组，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。CML-BC组患者NF-κB mRNA表达水平（22.91±0.15）明显高于对照组（0）及CML-CP组（11.19±0.03），差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 与慢性髓细胞白血病慢性期比较，急变期NF-κB活性增强，表达增加，可作为慢性髓细胞白血病急性病变的重要标志物。

慢性髓细胞白血病；核因子-κB；慢性期；急变期

［Abstract］Objective To study the changes of the NF-kB in acute transformation phase of chronic myelogenous leukemia and its significance.Methods From February 2011 to February 2013，25 cases of chronic myelogenous leukemia（CML-CP）（CML-CP group）；16 cases of chronic myelogenous leukemia patients in the acute transformation phase（CML-BC）（CML-BC group）；and 30 patients with iron deficiency anemia or gigantic young cell anemia（control group）in Department of Hematology of First People's Hospital of Kashgar District were selected as the research objects. Expression of NF-κB in bone marrow cells of the three groups were tested by EMSA.Results Activity determination of NF-κB in the control group were all negative，NF-κB activity of 4 patients in the CML-CP group were increased，and NF-κB of 14 patients in the CML-BC group were activity.Activation rate of the CML-BC group was higher than that of CML-CP group and the control group，the differences were statistically significant（P＜0.05 or P＜0.01）；activation rate of the CML-CP group was higher than that of the control group，the difference was statistically significant（P＜0.01）. The expression level of the NF-κB mRNA in the CML-BC group（22.91±0.15）was significantly higher than that of control group（0）and CML-CP group（11.19±0.03），the differences were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion Compared with the chronic phase of chronic myelogenous leukemia，activity of NF-κB in the CML-BC phase was enhanced， the expression was increased，so NF-κB can be used as an important marker in predicting of CML-BP of chronic myelogenous leukemia.

［Keywords］Chronicmyelogenousleukemia；Nuclear factorkappaBpredominate；Chronicphase；CMLBC phase

核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）蛋白家族是一种广泛存在于体内多种细胞的多效性蛋白质核转录因子，几乎表达于所有细胞的蛋白复合体，可以与多种基因启动子部位的κB位点发生特异性地结合从而促进其转录表达。当NF-κB被体内、外各因素诱导活化后，可转移至胞核内参与转录调控与恶性病变有关的基因的表达，从而发挥介导恶性肿瘤的发生、增殖，甚至诱导化疗及放疗耐受，决定肿瘤的组织构成和诱发黏膜损伤等。因此NF-κB过度活化可引起多种病理生理反应，且在很多肿瘤的发展中也起着非常重要的作用，可持续激活许多类型的人类癌症细胞［1］，与造血系统肿瘤如白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、泌尿系统肿瘤的发生密切相关［2-5］。本研究通过凝胶迁移或电泳迁移率实验 （Electrophoretic mobility shift assay，EMSA）以及免疫荧光法检测慢性髓细胞白血病慢性期（Chronic myelogenous leukemia-chronic phase，CML-CP）、慢性髓细胞白血病急变期 （CMLBC）以及非恶性血液系统疾病患者的NF-κB的表达，旨在探讨NF-κB在慢性髓细胞白血病急变期前后的变化。

1　资料与方法

1.1一般资料

选择2011年2月～2013年2月新疆喀什人民医院（以下简称“我院”）血液科住院的慢性髓细胞白血病患者。所有纳入本研究的患者均为成年患者，且符合张之南主编的2007版《血液病诊断及疗效标准》中的诊断标准。排除肝肾功能严重障碍者、心功能不全者、合并恶性肿瘤者、严重感染者。最终纳入慢性髓细胞白血病慢性期病例25例，男15例，女10例；年龄19～65岁，年龄（42.8±12.7）岁；血红蛋白水平为（59.2± 19.4）g/L。慢性髓细胞白血病急变期16例，男9例，女7例；年龄20～69岁，平均（39.5±10.2）岁；血红蛋白水平（53.8±18.3）g/L。同时选择我院同期其他科室诊断的非恶性血液病的缺铁性贫血或巨幼细胞性贫血患者30例为对照组，男15例，女15例，年龄18～65岁，平均（32.7±6.9）岁，血红蛋白水平（50.1±15.6）g/L。三组性别、年龄、血红蛋白水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。所有纳入对象均对研究知情同意并签署知情同意书。

1.2骨髓单个核细胞分离

无菌操作取骨髓8 mL，肝素（50 U/mL）抗凝，用等体积PBS液稀释混匀，缓慢加入等体积人淋巴细胞分离液，-20℃下2000 r/min，离心15 min，取界面层骨髓单个核细胞（MNC），用PBS液洗涤2次，在显微镜下计数，台盼蓝拒染率大于99%。于同一标本中，取约2×107个细胞，-80℃冻存，用于提取核蛋白；另取约3×106个细胞，加TrizoL试剂（美国Invitrogen）1 mL，充分混匀之后，-80℃冻存，用于提取RNA。

1.3NF-κB活化检测

应用EMSA方法进行NF-JB活化检测［4］，主要步骤包括：①核蛋白抽提和活性测定；②双链寡核甘酸探针制备：设计NF-κB特异结合探针，sense：5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3；antisense：3'-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5'；生物素进行5'端标记（上海博亚生物技术有限公司）；③DNA结合蛋白的凝胶电泳迁移测定：DNA/蛋白结合反应中，依次加入核蛋白5 μg，加水至20 μL，室温下放置20 min，加12p-探针2 μL，室温下放置30 min；上样，凝胶电泳（电压120 V）1 h，转膜（100 V）45 s，紫外交联10 s；④生物素自显影；⑤在图像分析处理系统上读取灰度面积值分析蛋白结合性。

1.4统计学方法

采用SPSS10.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析；计量资料用方差分析。计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1三组骨髓细胞中NF-κB活化情况比较

EMSA法检测各组NF-κB的活化水平结果显示，对照组患者的NF-κB活性测定均为阴性，CMLCP组也仅 4例患者检测到NF-κB活性稍增强，CML-BC组14例患者的NF-κB活性均增强。CMLBC组患者NF-κB活化率明显高于对照组及CMLCP组，差异有统计学意义 （P＜0.05或P＜0.01）；CML-CP组NF-κB活化率高于对照组，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1　三组骨髓细胞中NF-κB活化情况比较［n（%）］

2.2三组骨髓细胞中NF-κB mRNA表达水平

CML-BC组患者NF-κB mRNA表达水平明显高于对照组及CML-CP组，差异有统计学意义 （P＜0.05）；CML-CP组NF-κB mRNA表达水平与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2　三组骨髓细胞中NF-κB mRNA表达水平（x±s）

3　讨论

白血病是起源于造血干细胞的恶性克隆性肿瘤，死亡率极高，位居各类疾病死亡率的首位。其中白血病化疗缓解后复发是导致其高死亡率的重要原因，有效评估白血病患者疾病进展对疾病的有效控制极为重要。NF-κB是1986年Sen等［6］首次从淋巴细胞提取物中检测到的一种可与免疫球蛋白κ轻链基因增强子κB序列特异性结合的核蛋白因子。NF-κB蛋白家族由NF-κB1（p50/p105）、NF-κB2（p52/p100）、RelA（p65）、RelB及c-Rel组成，其共同特点是拥有一个约有300个氨基酸组成的高度保守的Rel同源区，该区可与DNA结合、二聚体化、抑制性卡巴蛋白（IKB）相互作用及核定位信号区域。当NF在胞浆中与抑制性卡巴蛋白结合时处于非激活状态，但能被肿瘤坏死因子、生长因子、氧化剂、病毒或药物等激活剂激活［7-9］，被激活的κB与抑制性卡巴蛋白解离，同时p65上的NSL被释放出来，促使p65/p50进入核内与靶基因的κB序列结合，形成NF-κB，导致表达及活性增强［10-11］。近年来，研究发现功能性NF-κB结合序列存在于多种细胞基因的启动子和增强子中，多种致癌因素均可通过激活NF-κB促进细胞生长、抗凋亡，使细胞发生恶性转化并促进肿瘤细胞的转移［12-13］。郑永亮等［14］收集急性白血病初治组、复发组和缓解组患者的骨髓及外周血标本，同时选取非恶性血液病患者作为对照。采用不同的实验方法分别检测了高迁移率蛋白B1（HMGB1）、NF-κB mRNA及蛋白质表达水平，结果发现在初治组与复发组骨髓单个核细胞中HMGB1、NF-κB表达水平较对照组明显升高，而在缓解组未见明显变化。结果提示HMGB1在急性白血病中过表达，它可能是通过激活NF-κB信号通路参与急性白血病的发生、发展。究其原因可能为NF-κB可激活细胞因子或其受体基因转录，从而促进非调节性淋巴细胞的生长或阻断凋亡。冯金等［15］研究发现，白血病细胞中存在NF-κB的持续性激活，其激活可导致白血病细胞凋亡受阻。胡亮杉等［16］研究发现，姜黄素诱导前后HL-60细胞中抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xl表达无明显变化，促凋亡基因Bid和Bax表达增高，NF-κB mRNA和蛋白表达均增高，并呈剂量依赖性，可见姜黄素能诱导HL-60细胞凋亡并上调促凋亡基因Bid和Bax，这可能与NF-κB表达上调有关。此外，NF-κB还可直接作用于细胞周期或DNA复制，从而导致恶性肿瘤的发生。目前国内关于NF-κB在血液系统恶性肿瘤的研究主要集中在急性髓细胞性白血病以及弥漫性大B细胞淋巴瘤上［17-18］，而关于慢性髓细胞性白血病急变期前后是否有NF-κB的变化鲜有相关报道。因此本研究集中观察NF-κB在慢性髓系白血病中的变化情况，以为后续研究做铺垫。

本研究采用EMSA法检测不同患者骨髓细胞中NF-κB的活化水平，结果显示，16例CML-BC样本中14例检测到了NF-κB转录因子的持续性激活，而25例CML-CP样本中仅4例样本检测到NF-κB活性稍稍增强，而30例对照组均仅检测到NF-κB的基础表达。在CML的慢性期中，NF-κB的低表达提示在CML中bcl-abl肿瘤蛋白的作用可能与NF-κB无关。而这一结果与此前Turhan等［19］和Reuther等［20］的研究结果相符合，他们的研究结果均认为，Bcr-Abl癌基因的抗凋亡活性在CML中与NF-κB无关，但CML急变期NF-κB有显著性的高表达。同时本研究还对各组骨髓细胞中NF-κB mRNA表达水平进行了半定量分析，结果发现，CML-BC组患者NF-κB mRNA表达水平明显高于对照组及CML-CP组，差异有统计学意义（P＜0.05），而CML-CP组NF-κB mRNA表达水平与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），进一步严验证了NF-κB在CML慢性期呈低表达，而在CML急变期表达活性及表达量均显著提高，与既往的大量研究结果相似［21-24］。刘婷婷等［25］的研究还对NF-κB基因表达与患者预后的关系进行了分析，结果发现，常核型急性髓细胞性白血病患者存在NF-κB基因的表达异常，NF-κB阳性者预后较差，是影响急性髓细胞性白血病患者预后的生物学指标之一。马武开等［26］研究还报道了通过激活NF-κB的转录参与了白血病细胞的耐药，通过抑制NF-κB的表达可降低白血病细胞的耐药性，如新型抗肿瘤靶向治疗药物硼替佐米，通过抑制与κB解离，减少NF-κB的核转位、抑制NF-κB的持续激活，产生促肿瘤细胞凋亡，从而增加细胞对放化疗的敏感性。

综上所述，NF-κB有可能成为CML急变期患者治疗的新靶点。但是相关研究还要继续深入，比如，慢粒急变期患者NF-κB的激活是否与AML患者相同，以及CML-BC期NF-κB的持续活化是否与Bcr-Abl癌基因相关，都值得继续探讨。

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Changes of the NF-κB in acute transformation phase of chronic myelogenous leukemia

Aikebaier·Abudureyimu1XU Li1Ayimunisa·Abudureheman1Hairesa·Abulimiti1LIU Jiajun2▲
1.Department of Hematology，the First People's Hospital of Kashgar District，Xinjiang Uygur Autonomous Region，Kashgar844000，China；2.Hematology Institute of Sun Yat-sen University，Guangdong Province，Guangzhou 510630，China

R733.7

A

1674-4721（2016）08（b）-0016-04

2016-05-05本文编辑：任念）

新疆维吾尔自治区科技厅少数民族科技人才特殊培养计划科研项目（201323132）。

艾克拜尔·阿布都热衣木（1974-），男，硕士，副主任医师；研究方向：白血病。