E钙黏蛋白和基质金属蛋白酶-9在盆底器官脱垂患者宫骶韧带中的表达及相关性分析

王　红　洪　莉武汉大学人民医院妇产科，湖北武汉　430060

E钙黏蛋白和基质金属蛋白酶-9在盆底器官脱垂患者宫骶韧带中的表达及相关性分析

王红洪莉
武汉大学人民医院妇产科，湖北武汉430060

目的 探讨E钙黏蛋白和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）在盆底器官脱垂（POP）患者子宫骶韧带中的表达情况，并分析两者的相关性。方法 选取2015年1月～2016年1月武汉大学人民医院妇产科子宫全切患者55例，分为三组，其中轻度POP组（POPⅠ～Ⅱ度）15例，重度POP组（POPⅢ～Ⅳ度）22例，正常组（非POP患者）18例，采用蛋白质印迹法检测三组患者子宫骶韧带组织中E-钙黏蛋白和MMP-9的表达情况，比较分析两者在各组的相关性。结果 轻度POP组及重度POP组的E-钙黏蛋白表达显著低于正常组（P＜0.01），而MMP-9的表达高于正常组（P＜0.05或P＜0.01），并且E-钙黏蛋白的降低和MMP-9的升高随POP严重程度加重而加大；E-钙黏蛋白和MMP-9在轻度和重度POP组的表达呈负相关（r=-0.5612，P=0.0295；r=-0.6221，P=0.002）。结论E-钙黏蛋白降低和MMP-9的升高可能是POP发病机制之一，二者可能共同参与了POP的发生发展。

盆底器官脱垂；E-钙黏蛋白；基质金属蛋白酶-9；相关性分析

［Abstract］Objective To investigate expression of E-cadherin and matrix metalloproteinase-9（MMP-9）in uterosacral ligament of women with pelvic organ prolapse and analyze the correlation between the two proteins.Methods Fifty-five patients undergoing hysterectomy were selected from January 2015 to January 2016 in the Department of Gynecology and Obstetrics of Renmin Hospital of Wuhan University，then they were divided into three groups：the mild group（POPⅠ-Ⅱ，15 cases），the severe group（POPⅢ-Ⅳ，22 cases）and control group（without POP，18 cases）.Western blot was used to detect E-cadherin and MMP-9 of the uterosacral ligament tissues taken from patients of the three groups，then the differences and correlation of the expression of both proteins were analyzed among the three groups.Results The level of E-cadherin in the mild group and the severe group was lower（P＜0.01）and MMP-9 was higher than those of the control group（P＜0.05 or P＜0.01），the decrease of E-cadherin and the rise of MMP-9 increased with severity increase of POP.There was a significant negative correlation between the two proteins in the mild group and the severe group（r=-0.5612，P=0.0295；r=-0.6221，P=0.002）.Conclusion The down-regulation of E-cadherin and up-regulation of MMP-9 in uterosacral ligament tissues may be one of the pathogenesis of POP.The both proteins may paticipate in the pathogenesis of POP.

［Key words］Pelvic organ prolapse；E-cadherin；Matrix metalloproteinase-9；Correlation analysis

盆腔器官脱垂（Pelvic organ prolapse，POP）是由于盆底支持功能减弱和盆底固有肌及韧带功能缺陷等引起的一组疾病，主要包括子宫脱垂、阴道前壁膨出、阴道后壁膨出等。POP是中老年妇女的多发病，研究表明在国内约有30%的中老年妇女有着不同程度的盆底器官脱垂［1］。其症状有阴道肿物膨出、疼痛、局部溃疡及其引起的妇科炎症等，在很大程度上影响了中老年妇女的生活质量。相关调查研究显示，在美国每年用于POP手术治疗的费用高达10亿美元［2］，给患者带来严重的精神和经济负担，研究POP的发病机制具有重要的理论和临床价值。相关的流行病学调查发现，其发病主要与分娩、年龄、肥胖、慢性腹压增加及绝经等因素相关［3］。然而，POP发病具体的分子机制尚未完全明了，缺乏充分的病因学理论解释POP的发病，许多研究证实POP发病与细胞内骨架及细胞外基质（Extra cellular matrix，ECM）的代谢密切相关［4-6］。本研究中，选取E钙黏素（E-cadherin）和基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）两项细胞外基质相关成分，检测它们在POP患者子宫骶韧带中的表达情况，并分析两者关系，旨在进一步阐明POP发病的相关分子机制。

1　资料与方法

1.1一般资料

选取2015年1月～2016年1月在武汉大学人民医院（以下简称“我院”）行子宫全切术患者55例，其中患POP行子宫全切术的患者37例作为POP组，并以同期因子宫腺肌症、子宫肌瘤或功能性子宫出血等良性疾病（均未累及宫骶韧带），而无POP或尿失禁行子宫全切术的患者18例作为正常组。根据国际尿控协会（International Continence Society，ICS）1996年公布的POP-Q分类法对POP进行分度，以POPⅠ～Ⅱ度患者作为轻度POP组（此组患者切除子宫的主要指征为CINⅡ或Ⅲ，且合并轻度POP），共15例；POPⅢ～Ⅳ度患者作为中度POP组，共22例。各组患者均为阴道分娩和绝经者，既往无激素使用史，无明显的盆腔炎症、无糖尿病或高血压等疾病、无各种慢性疾病。参与本研究的所有患者均知情同意并签署知情同意书，且本研究已经我院医学伦理委员会审查批准。

1.2样本来源

在各组患者行子宫全切术中，切取距离宫颈约0.5 cm处的宫骶韧带组织，长约0.5 cm。用PBS清洗血液、剪去脂肪等组织，并用液氮短期保存，以备后期提取组织总蛋白。

1.3实验方法

1.3.1组织总蛋白提取将各组液氮冻存的组织取出并编号，用研钵研磨，加入裂解液充分裂解，离心后提取上清，并使用蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所）测总蛋白浓度，然后加入上样缓冲液煮沸，放入-20℃冰箱保存，以备后期Western blot检测蛋白表达。1.3.2 Western blot检测蛋白表达 运用Western blot检测E-cadherin和MMP-9在各组患者宫骶韧带中的表达情况。主要的操作步骤包括：配胶（分离胶10%）、上样、电泳、转膜（PVDF膜）、封闭、一抗孵育、二抗孵育、扫描分析。主要的试剂及器材：E-钙黏蛋白小鼠抗人单克隆抗体 （Abcam，USA），MMP-9和GAPDH兔抗人单克隆抗体 （Abcam，USA）、Tris-HCL缓冲盐溶液（TBS）、奥德赛扫描仪（Odyssey，Li-cor，USA）。

1.4统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；采用Pearson相关性检验进行相关性分析；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1三组患者基本参数比较

收集记录与POP相关的主要因素，如年龄、体重指数（BMI）、阴道分娩次数。三组3个指标比较，差异无统计学差异（P＜0.05）。见表1。

表1　各组患者基本参数比较（x±s）

2.2三组患者宫骶韧带组织中E-钙黏蛋白及MMP-9的表达情况

正常组、轻度POP组和重度POP组三组宫骶韧带组织中E-钙黏蛋白表达分别为37.91±3.41、32.65± 3.36和26.11±3.24，两两比较，差异均有高度统计学意义（P＜0.01）。正常组、轻度POP组和重度POP组三组MMP-9蛋白分别为24.38±2.94、27.61±2.40和31.09± 3.59，两两比较，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.0）。见图1。

图1　E-钙黏蛋白和MMP-9在三组中的表达

2.3三组患者宫骶韧带组织中E-钙黏蛋白和MMP-9表达的相关性分析

根据E-钙黏蛋白和MMP-9在各组的表达量绘制散点图，采用Pearson相关性检验发现，在正常组中E-钙黏蛋白表达与MMP-9无明显相关性（r=0.377，P=0.123），而在轻度POP组合重度POP组，两蛋白的表达呈显著负相关（r=-0.5612，P=0.0295；r=-0.6221，P=0.002）。见图2。

图2　三组患者宫骶韧带组织中E-cadherin和MMP-9表达的相关性分析

3　讨论

女性的盆底组织受复杂的生物力学和雌激素影响，妊娠、分娩等引起的腹压变化以及雌激素的撤退都将引起POP的发生和发展。盆底的韧带和肌肉是维持盆底器官正常解剖位置的基础，而子宫主骶韧带是提供力学抗性的关键结构，其主要成分是肌肉和胶原纤维，任何原因引起的盆底肌肉和胶原纤维的断裂和退行性变化都能引起盆底支持结构的松弛，进而导致POP或者压力性尿失禁（Stress urinary incontinence，SUI）［7］。

钙黏蛋白是一组存在于细胞表面的糖蛋白，它可以通过钙依赖型的分子机制发挥其保持细胞间黏附的作用。E-钙黏蛋白属于钙黏蛋白家族的一员，广泛存在于各类上皮细胞之中，主要介导同型细胞间的黏附反应，还可以通过与细胞内的配合基连环蛋白αβ和γ发挥细胞骨架的作用，其表达的丢失将使细胞失去极性并和周围细胞分离。近年来E-钙黏蛋白的研究主要集中在肿瘤的转移、侵入等方面［8-9］。在MMPs家族中，MMP-2和MMP-9是主要成员，并与细胞外基质的重塑修复关系密切。然而，E-钙黏蛋白与MMP-9关系密切，在Llorens等［10］的研究中证实了E-钙黏蛋白能够调节MMP-9的表达，能够抑制肿瘤细胞或者宿主细胞产生基质金属蛋白酶，并且有效减少肿瘤细胞周围的基质以及基底膜中的各种细胞外基质的降解，并且在一项大鼠肾间质纤维化的研究中也得到了类似的结果［11］。在盆底支持组织中主要的细胞成分是肌肉细胞和成纤维细胞，已经证实了成纤维细胞合成、分泌的弹性纤维和胶原蛋白是保持盆底支持组织强度和韧性的关键成分［12-13］。胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，在盆底支持组织中发挥重要的作用。而MMP-9又称为明胶酶，主要功能是分解细胞外基质，降解胶原蛋白并改变胶原蛋白的性状。许多研究已经证实，MMPs作为细胞外基质重要的降解酶，在组织的修复、血管发生、凋亡、肿瘤植入和转移中发挥着重要的作用［14-16］。MMP-9在盆底组织的细胞外基质的合成和降解中发挥着关键的作用，一旦盆底结缔组织受到炎症、细胞因子、机械力等刺激时，便会刺激MMP-9的合成，引起富含胶原的组织的可塑性和完整性遭到破坏［17］，进而导致POP或SUI的发生发展。

在本研究中，POP患者盆底宫骶韧带中的E-钙黏蛋白较非POP患者是显著降低的，然而MMP-9的含量则是升高的。MMP-9的过度升高将极大地增加细胞外基质的降解，胶原蛋白减少，引起成纤维细胞的功能缺陷，从而导致POP的发生和发展。前面提到E-钙黏蛋白可以结合细胞内的配合基连环蛋白αβ和γ，起到细胞骨架的作用，它的减少也可能会引起成纤维细胞结构的完整性，并且其黏附作用的降低对盆底结缔组织的稳定性也有负性作用。从本研究中E-钙黏蛋白和MMP-9的相关性分析可以看出两者在轻度POP组和重度POP组中呈现负相关性。曾有报道把表达E-钙黏蛋白的基因片段转染进前列腺腺癌细胞中，发现MMP-2的表达降低，肿瘤的侵袭能力也降低［18］，并且E-钙黏蛋白的下调会导致MMP-9活性升高［10］。在Munshi等［19］的一项关于口腔角质化的研究中也发现了E-钙黏蛋白能够降低MMP-9的合成，另一项类似的研究也显示在大鼠角质细胞中E-钙黏蛋白的表达降低与MMP-9的表达升高密切相关［20］。在胎盘植入时E-钙黏蛋白可以通过调节MMP-2与MMP-9 mRNA的表达和MMP-2与MMP-9的明胶活性来参与其中［21］。然而，同时也有研究显示MMP-9作为蛋白激酶参与E-钙黏蛋白的分解［22］，并且MMP-9是表皮生长因子受体依赖型的E-钙黏蛋白减少的调节者，其表达升高能够单独造成E-钙黏蛋白和黏附节点的丧失［23］。E-钙黏蛋白与MMP-9的负相关性在本研究中也得到了证实，这种负相关性在POP分度越高的患者中表现越明显，E-钙黏蛋白与MMP-9可能存在因果关系，在POP的发病和发展中这两者的相关性可能存在重要意义。

综上所述，在POP患者的盆底骶韧带中E-钙黏蛋白的表达降低，MMP-9表达升高，两者呈负相关，推测两者可能存在因果关系，在本研究中并不能得出何者是因何者是果，两者间可能存在相联系的细胞因子或者信号分子，是POP发病机制之一。然而，两者具体的关系以及通过何种途径相联系在POP发生发展中发挥作用，还需要更多更深入的研究，以期在POP的预防和治疗上寻找新的靶点。

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Expressions of E-cadherin and matrix metalloproteinase-9 and correlation in uterosacral ligament of women with pelvic organ prolapse

WANG HongHONG Li
Department of Gynecology and Obstetrics，Renmin Hospital of Wuhan University，Hubei Province，Wuhan430060，China

R711.2

A

1673-7210（2016）08（b）-0098-04

2016-05-04本文编辑：任念）

武汉大学医学部协同创新项目（523-266078）。

王红（1983.9-），女，武汉大学人民医院妇产科专业2012级在读硕士研究生；研究方向：腹腔镜在妇科肿瘤中的应用。

洪莉（1970-），医学博士，教授；研究方向：盆底功能障碍性疾病和妇科肿瘤。