抑制PTEN在小鼠内毒素性肺损伤中的作用

王　标　王泽宇　彭　誉　玉章峰　吴允孚南京医科大学附属苏州医院 苏州市立医院重症医学科，江苏苏州，215001

抑制PTEN在小鼠内毒素性肺损伤中的作用

王标王泽宇彭誉玉章峰吴允孚
南京医科大学附属苏州医院 苏州市立医院重症医学科，江苏苏州，215001

目的 探讨抑制同源物基因（PTEN）在小鼠内毒素（LPS）性急性肺损伤中的作用。方法 C57BL/6小鼠，8～10周龄，随机分为4组：对照组（control组，n=6）、LPS组（n=12）、Wortmannin+LPS组（n=12）和Phen+LPS组（n= 12）。对照组气管内滴入等体积生理盐水，Wortmannin+LPS组和Phen+LPS组腹腔注射Wortmannin 0.6 mg/kg和Phen 1.6 μmoL/kg，1 h后气管内滴入LPS 5 mg/kg，LPS组气管内滴入LPS 5 mg/kg。注射脂多糖或生理盐水后6 h时处死动物，取肺组织，光镜下观察病理学结果，进行肺损伤评分、肺组织湿重/干重比值（W/D比值），以及肺系数、肺水含量、肺通透指数、肺血管通透性、血气分析指标的测定。结果Phen+LPS组的肺损伤评分、肺组织W/D比值、肺系数、肺水含量、肺通透指数、PCO2均显著低于LPS组（P＜0.05），但高于对照组（P＜0.05）。与Wortmannin+LPS组比较，肺损伤评分、肺组织W/D比值、肺系数、肺水含量、肺通透指数、PCO2和病理评分均显著降低（P＜0.01）。结论 抑制PTEN可降低肺水肿参数，降低肺血管通透性。

同源物基因PTEN；肺损伤；肺血管通透性

［Abstract］Objective To investigate the role of inhibition of the PTEN in LPS-induced acute lung injury in mice. Methods 42 C57BL/6 mice，aged 8-10 weeks，were randomly divided into four groups as follows：control group（n=6），LPS group（n=12），Phen+LPS group（n=12）and Wortmannin+LPS group（n=12）.In control group，the equal volume of normal saline was given via the intratracheal instillation.In Phen+LPS group and Wortmannin+LPS group，Phen 1.6 μmol/kg and Wortmannin 0.6 mg/kg were given respectively by intraperitoneal injection.And 60 min later，lipopo lysaecharide（LPS）5 mg/kg was injected via the intratracheal instillation in Phen+LPS group and Wortmannin+LPS group，while the equal volume of LPS was given in LPS group．The mice were sacrificed at 6 h after LPS or normal saline injection．The lung was immediately removed for microscopic examination and for determination of wet/dry lung weight ratio（W/D ratio），the levels of lung index，lung water，lung penetrating index（LPL）and lung vasopermeability. The arterial blood gas was analysed and the pathological changes of the lung were scored.Results Compared with LPS group，the lung injury scores，W/D ratio，lung index，lung water，lung penetrating，PCO2and pathology score in Phen+ LPS group decreased significantly（P＜0.05），but higher than those in control group（P＜0.05）.Those in Phen+LPS group decreased significantly in comparison with Wortmannin+LPS group（P＜0.01）.Conclusion Inhibition of the PTEN has protective effects on pulmonary vascular permeability in LPS-induced acute lung injury.

［Key words］PTEN；Acute lung injury；Pulmonary vascular permeability

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是由肺炎性细胞浸润和微血管通透性增加引起的非心源性肺水肿和顽固的低氧血症［1-3］。磷脂酰肌醇-3羟基激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/Akt信号转导通路是一个促进细胞生长、存活、分化的信号通路，激活该通路能保护肺上皮细胞和缓解肺部炎症［4-5］。PI3K特异性的抑制剂渥曼青霉素（wortmannin）可破坏由1-磷酸鞘氨醇（Sphingosine-1-phosphate，S1P）产生的增强血管内皮细胞结构的完整性和减少血管外水分积聚的能力［6］。10号染色体上缺失的磷酸酶与张力蛋白同源物基因（phosphatase and tensinhomologue deleted from chromosome 10，PTEN）是PI3K/Akt通路主要的负性调节器，从而抑制PI3K/Akt信号通路［7-9］。Phen是PTEN的特异性抑制剂［10］，目前已被广泛的应用于科学研究。本文通过研究抑制PTEN来探讨其在内毒素（LPS）诱导ALI中的作用。

1　材料与方法

1.1一般材料

内毒素（LPS，Sigma公司），渥曼青霉素wortman-nin（Sigma公司），phen（Santa Cruz公司），Gem premier 3000型血气分析仪（GE公司），其余试剂均为国产分析纯。

1.2小鼠ALI模型及分组

8～10周龄雌性C57BL/6小鼠42只（购自苏州大学实验动物中心，动物合格证号SYXK苏2014-0045），采用随机数字表法分为4组：对照组（control组，n=6），LPS组（n=12），Wortmannin+LPS组（n=12），Phen+LPS组（n=12）。参照文献［11］，采用气管内滴入LPS 5 mg/kg构建内毒素性急性肺损伤模型，对照组仅注射等体积生理盐水，Wortmannin+LPS组和Phen+LPS组，在注射LPS前1 h腹腔注射Wortmannin 0.6 mg/kg和Phen 1.6 μmol/kg。本研究遵循《实验动物福利伦理审查指南》，并经苏州市立医院实验动物伦理委员会批准。

1.3肺组织病理学的观察

在注射后6 h，经腹主动脉抽动脉血0.5 mL行动脉血气分析后处死动物，冷 PBS灌洗3次，清除、吸干表面血渍和水分。取右肺上叶，浸泡于10%中性甲醛溶液中固定，脱水透明后用石蜡包埋制成蜡块。切成厚5 μm的连续石蜡切片，经苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，在光镜下观察肺组织的病理学变化。参照文献［12］介绍的方法进行肺损伤评分，根据肺泡腔及间隔中性粒细胞渗出、肺泡间隔增宽、肺泡腔出血、肺泡腔纤维蛋白渗出改变，按程度“无、轻、中、重”分别计“0、1、2、3分”。取4项评分之和为肺损伤评分。每张切片随机选取10个视野进行评分，取平均值。取右肺中叶组织用于测定肺的湿/干重比值（wet/dry，W/D）。

1.4肺系数、肺水含量及肺通透指数测定

取左肺，计算肺系数（lung index）：肺湿重/体重× 100。取左肺上叶测定肺水含量：（肺湿重-肺干重）/肺湿重×100%。取左肺下叶行支气管肺泡灌洗，用Lowry法收集支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fiuid，BALF），取上清液测蛋白含量，计算肺通透指数（lung permeability index，LPI）：肺泡灌洗液上清液蛋白含量/血浆蛋白含量。

1.5伊文思蓝（evans blue，EB）肺血管通透性的检测

另取C57BL/6小鼠18只，分组后建立肺损伤模型，经尾静脉按20 mg/kg注射EB，30 min后处死小鼠，打开胸腔，充分暴露视野，穿刺右心室进入小鼠肺动脉，用剪刀剪去左心耳，以10 mL生理盐水20 cmH2O压力循环冲洗肺动脉，取两肺下叶各20 mg，100 mg肺组织配比1 mL甲酰胺进行研磨，取得液体放入60℃温箱温育18 h，离心取上清液进行EB浓度的检测。

1.6统计学方法

应用SPSS 13.0软件系统进行统计分析，结果用均数±标准差（x±s）表示。组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1肺损伤评分和W/D比值

结果表明，Phen+LPS组的肺损伤评分和肺组织W/D比值显著低于LPS组（P＜0.01），但高于对照组（P＜0.01）；与Wortmannin+LPS组比较，Phen+LPS组肺损伤评分和肺组织W/D比值降低 （P＜0.01）。见表1。

表1　抑制PTEN对小鼠肺损伤评分和肺组织W/D比值的比较（x±s）

2.2肺组织的病理学变化

显微镜下观察，对照组肺泡壁完整；LPS组和Wortmannin+LPS组肺泡壁破坏，肺泡及肺间质内积聚较多水肿液，肺泡腔内大量中性粒细胞渗出，毛细血管扩张出血；Phen+LPS组肺组织病理变化减轻。Phen+LPS组的病理评分显著低于LPS组（P＜0.01），但高于对照组（P＜0.01）。见图1。

图1　肺组织病理表现 （HE染色，100×）

2.3肺系数、肺水含量、肺通透指数变化

结果表明，Phen+LPS组的肺系数、肺水含量、肺通透指数显著低于LPS组（P＜0.01），但高于对照组（P＜0.05）；与Wortmannin+LPS组比较，Phen+LPS组肺系数、肺水含量、肺通透指数降低（P＜0.01）。见表2。

表2　抑制PTEN对小鼠肺水肿参数的影响（x±s）

2.4肺血管通透性变化

根据单位组织中 EB含量（mg）表示血管通透性大小。结果表明，Phen+LPS组的EB含量（0.87±0.03）显著低于LPS组（1.00±0.04）（P＜0.01），但高于对照组（0.84±0.01）（P＜0.05）；与Wortmannin+LPS组（1.21± 0.04）比较，Phen+LPS组的EB含量降低（P＜0.01）。

2.5血气指标的变化

结果表明，Phen+LPS组的PO2、pH值显著高于LPS组（P＜0.01），但低于对照组（P＜0.05）；PCO2低于LPS组 （P＜0.01），但高于对照组 （P＜0.05）；与Wortmannin+LPS组比较，Phen+LPS组的PO2、pH值显著升高（P＜0.01），PCO2显著降低（P＜0.01）。见表3。

表3　抑制PTEN对小鼠血气分析数值的影响（x±s）

3　讨论

ALI是在严重感染、创伤、休克等非心源性疾病发病过程中，肺毛细血管上皮细胞和肺泡内皮细胞损伤造成的肺弥散功能的严重损害［1］。

PTEN蛋白是PI3K/Akt通路主要的负性调节器，抑制PI3K/Akt信号通路，Phen是PTEN的特异性抑制剂［13］。Wortmannin是非ATP竞争型P13K抑制剂，与P13K的110 kD催化亚基结合，特异性抑制P13K的活性，从而阻断P13K/Akt信号通路［14-16］。有研究发现PI3K/Akt信号转导通路是保护肺上皮细胞和缓解肺部炎症的重要通路之一［13］，激活该信号通路能显著延迟急性肺损伤的开始，导致动物存活率升高［17-19］。

本研究参照文献［11］介绍的方法，气管内滴注LPS 5 mg/kg制备内毒素性急性肺损伤模型，结果表明，LPS组肺损伤评分和肺组织W/D比值升高，提示急性肺损伤模型制备成功。本实验以小鼠内毒素性肺损伤动物模型为基础，分别加入Wortmannin和Phen进行干预，发现Phen+LPS组可明显减轻内毒素性肺损伤的严重程度，使肺毛细血管通透性及氧合指数改善。通过小鼠肺组织病理学变化发现，Phen干预后肺泡及间质内水肿液、中性粒细胞浸润程度较LPS组明显减轻，提示抑制PTEN通过病理变化等对内毒素介导的急性肺损伤发挥保护作用。

进一步对比Phen+LPS组和Wortmannin+LPS组的结果发现，Phen+LPS组的肺损伤评分、肺组织W/D比值、肺系数、肺水含量、肺通透指数、PCO2和病理评分均较Wortmannin+LPS组显著降低 （P＜0.01），病理结果亦提示肺泡水肿、炎细胞浸润等肺损伤程度减轻，提示早期 Phen防治内毒素性肺损伤效果较Wortmannin好。

Miyoshi等研究表明，肺泡上皮通过PTEN/P13K/ Akt通路能有效地控制肺损伤和肺纤维化的发展［20］。本实验结果与其一致，采用Phen干预抑制PTEN/ P13K/Akt通路可以减轻内毒素所导致的急性肺损伤，降低损伤后的肺血管通透性，其作用机制可能与增强血管内皮细胞结构的完整性，减少血管外水分的积聚有关。

综上所述，抑制PTEN可减轻内毒素性急性肺损伤肺泡水肿、改善毛细血管的通透性。

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Role of PTEN inhibition in LPS-induced acute lung injury in mice

WANG BiaoWANG ZeyuPENG YuYU ZhangfengWU Yunfu
Department of Critical Care Medicine，Suzhou Hospital Affiliated to Nanjing Medical UniversitySuzhou Municipal Hospital，Jiangsu Province，Suzhou 215001，China

R563

A

1674-4721（2016）08（b）-0025-04

2016-04-20本文编辑：赵鲁枫）

江苏省苏州市科教兴卫工程资助（KJXW2013028）。