玉米(zea mays.L)ZmCen基因原核表达载体的构建及表达体系的优化

雷海英，白凤麟，王志军

（1.长治学院生物科学与技术系，山西长治046011；2.长治学院化学系，山西长治046011）



玉米(zea mays.L)ZmCen基因原核表达载体的构建及表达体系的优化

雷海英1，白凤麟1，王志军2

（1.长治学院生物科学与技术系，山西长治046011；2.长治学院化学系，山西长治046011）

以玉米(zea mays L.)cDNA为模板，并将其构建到带有GST表达标签的原核表达载体pGEX-6p-1中，构建的重组载体pGEX-6p-Zmcen转化至大肠杆菌BL21（DE3）。为表达出较大量的可溶性GST-ZmCen融合蛋白，设置0.1 mmol/L,0.3 mmol/L和0.5 mmol/L IPTG3种不同浓度，诱导温度和4 h、16 h和20 h的诱导时间建立正交体系，诱导产物经超声波裂解破碎细胞后，通过12%SDS-PAGE比较分析融合蛋白表达量，从而确定最佳的表达体系。结果显示：当诱导温度28℃，IPTG浓度为0.3 mmol/L，诱导20 h时可以获得较大量的45kD可溶性融合蛋白（GST-ZmCen）表达量。

玉米；中心蛋白；原核表达；体系优化

1　引言

作为真核细胞胞质骨架的主要成分之一，微管组织中心（Microtubule-organizing centre，MTOC）不仅为微管提供了生长的起点，而且还决定了微管的方向性。其复制的改变会导致细胞分裂中止或癌症的产生[1,2,3]。微管组织具有多种功能，如纤毛和鞭毛的运动、细胞运动和胞质流动、染色体运动、细胞形态的维持、细胞内外的运输、细胞表面受体的固定等[4]。存在于细胞内的中心粒是主要的微管组织中心，但真正起微管组织作用的不是中心粒本身，而是中心粒周围的蛋白或与之相当的物质。高等植物由于没有特殊结构的MTOC，只能靠其他一些含微管相关蛋白的细胞器来行使类似的功能。中心蛋白是作为MTOC或中心粒周围的蛋白保守成分之一。已有研究表明，中心蛋白具有保守的EF-hand钙结合蛋白，分子量约20 kD的酸性蛋白，属于钙调蛋白超家族中的一员，也是负责MTOC细胞复制和分裂所必需的蛋白之一[5,6]。中心蛋白最早是从绿藻[7]中鉴定得到的，目前很多研究主要集中在哺乳动物、低等植物等，对高等植物的中心蛋白研究较少，迄今为止克隆到的中心蛋白基因主要有盐沼植物滨藻Atriptex thaliana的AtCen[8]，拟南芥Arabidops thaliana的AtCen[9]，烟草Nicotiana tabacum的两个同源基因NtCenl和NtCen2[10]，水蕨Marsilea vestita 的MvCen[11]等，它们内部约有77%-78%的同源性。中心蛋白在细胞有丝分裂、纺锤体的分离、纤维的收缩等过程中起重要作用[12]。

文章克隆了玉米中心蛋白Zmcen基因，为能诱导表达出较大量的可溶性中心蛋白，对表达体系进行了优化，为后续的相关性质研究奠定了基础。

2　实验方法

2.1材料与试剂

试验所用玉米自交系材料郑58，种子由山西省农业科学院生物技术研究中心提供，在本实验室花盆种植一周后，取其新鲜叶片提取总RNA。本研究中Trizol总RNA抽提试剂盒、Taq DNA聚合酶、IPTG、DNA Marker、琼脂糖、RT-PCR试剂盒、限制性内切酶BamH I、Sal I、T4 DNA连接酶均购Takara公司产品；原核表达载体pGEX-6p-1由山西大学分子研究所杨斌盛教授实验室惠赠；凝胶回收试剂盒、小量制备质粒DNA试剂盒为Omega公司产品；大肠杆菌BL21(DE3)为本实验室保存；PCR引物合成、样品测序均由上海生工生物工程有限公司完成。

2.2实验方法

2.2.1总RNA提取

取玉米一周的幼苗0.1～0.2 g，液氮中研磨成粉末，提取总RNA，提取方法参照TaKaRa公司Trizol 总RNA抽提试剂盒说明书，1%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量，微量紫外分光光度计（Nano2000，America）定量RNA样品。

2.2.2RT-PCR法

参照RT-PCR试剂盒说明书，去除基因组DNA后，将总RNA反转录成cDNA，反应体系为37℃15 min；85℃5 s；后置于4℃保存。

2.2.3重组载体的构建

以Zmcen基因的cDNA作为模板，使用Primer5.0软件设计PCR扩增引物：上游引物为mL：5′-GCC GGATCC ATGAGTTTCAACCAGT-3，下游引物为mR：5′-GCC GTCGACTCAAGCACTC ACAGA-3′。(画线部分分别为BamH I、Sal I限制性内切酶酶切位点，下游引物中TCA为终止密码子)。PCR反应体系为20 μL，PCR反应程序：94℃预变性5 min，94℃35 s，55℃40 s，72℃3 min，72℃7 min，30个循环。PCR产物用1%琼脂糖电泳检测扩增片段。

将回收纯化后的PCR产物和表达载体pGEX-6p-1分别用Bam H I、Sal I双酶切，纯化试剂盒回收PCR扩增产物，1%琼脂糖电泳回收线性载体。目的DNA片段与双酶切后的线性pGEX-6p-1载体连接，构建pGEX-6p-Zmcen重组载体，转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素（50 μg/mL）的固体LB培养基上于37℃培养过夜，挑取单克隆进行菌落PCR扩增，同时保存备份菌液。经菌液PCR初步鉴定正确后，送由上海生工生物工程有限公司进一步测序鉴定。

2.2.4表达条件优化

取已构建转化好的原核表达菌株pGEX-6p-Zmcen-BL21单菌落接到10 mL含氨苄青霉素（50μg/mL）的LB培养基中，37℃震荡培养过夜。次日，将过夜培养菌液按1︰100的比例接入含50μg/mL氨苄的LB培养基中培养2-3h，当菌液浓度至OD600=0.6-0.8时，分别对IPTG浓度、诱导温度及诱导时间三种条件设置三因素三水平正交实验，IPTG终浓度分别设定为0.1mmol/L，0.3 mmol/L，0.5mmol/L，诱导温度设定为20℃，28℃，37℃，诱导时间分别为4 h，16 h，20 h时留取样品，同时留取空载体和不诱导样品作为对照组，离心收集菌体，沉淀菌体用PBS缓冲液（140 mmmol/L NaCl，2.7 mmmol/L KCl，10 mmmol/L Na2HPO4，1.8 mmmol/L KH2PO4，pH7.4）清洗1次，5000 rpm/min离心10 min，沉淀加500 μL PBS缓冲液，超声波破碎细胞，频率为20KHz，超声处理3-5 s，间隙3-5 s。持续10-15min后，离心，取上清4℃储存备用。蛋白样品中加入等体积的2×SDS上样缓冲液，混匀，100℃煮沸5min，12%SDS-PAGE电泳检测。通过分析蛋白表达量确定最佳表达体系。

表1　BL21重组菌正交实验设计L9(33）Tab.1 BL21 Recombinant bacteria orthogonal experiment program L9(33）

3　结果与讨论

3.1玉米ZmCen cDNA序列扩增

经RT-PCR扩增后，扩增产物由1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1A所示，扩增片段特异性强，无杂带，带有酶切位点和保护碱基序列的ZmCen的目的条带大小为534 bp，其CDS序列与预期的序列大小相符，初步确定这些扩增片段为目的片段，回收目的片段用于重组载体的连接。

3.2ZmCen cDNA重组载体的构建

将构建的重组载体pGEX-6p-Zmcen转化大肠杆菌BL21（DE3），筛选克隆提取质粒双酶切鉴定，菌落PCR扩增产物，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，有目的条带的阳性克隆送至上海生工测序鉴定（图1A/1B），阳性克隆测序结果如图2所示，测序结果包含有完整的ORF，且没有突变和移码，与NCBI报道的玉米基因Zea mays caltractin（LOC100284444）mRNA的cDNA序列一致，其CDS长为516bp，编码172个氨基酸证明已成功克隆出了Zmcen cDNA。经测序公司鉴定后命名为pGEX-6p-Zmcen-BL21，用于后续蛋白表达。

图1　玉米ZmCen扩增（A）与重组载体鉴定（B）的电泳结果图A：DL1000 DNA Marker与PCR扩增产物；B：M1与M2分别为DL1000、λHind III DNA Marker，1与2分别为重组载体pGEX-6p-ZmCen的质粒与酶切产物Fig.1 PCR amplification of ZmCen gene(A)and the recombinant plasmid digested by restriction endonuclease of pGEX-6p-AtCen2(B),A:M,DL1000 DNA Marker;1,The product of PCR amplification.B:M1 and M2 were DL1000 and λHind III DNA Markers.1,The recombinant plasmid;2,The product of the recombinant plasmid pGEX-6p-ZmCen digested.

图2　ZmCen cDNA克隆测序结果及氨基酸序列Fig2ThecDNAandanomyacidsequencesofZmCengene

3.3中心蛋白的原核诱导表达

由于在预实验中重组pGEX-6p-Zmcen-BL21菌株在通常的表达体系中难以表达出较大量的可溶性蛋白，经过体系的调整也只能有少量的可溶性蛋白出现，而大量的蛋白只以包涵体的形式出现，不利用后续蛋白分离纯化的利用。因此，为使重组菌株pGEX-6p-Zmcen-BL21的目的基因Zmcen能大量在上清中表达出可溶性的蛋白，通过设置正交实验，对3种不同温度、3种IPTG浓度及3个不同的诱导时间，进行融合蛋白GST-ZmCen诱导表达。不同诱导体系的超声破碎产物经12% SDS-PAGE电泳分析，从而确定能够表达出较大量可溶性蛋白的最佳体系，其代表性的电泳结果如图3所示。

图3　玉米ZmCen不同诱导条件下的12%SDS-PAGE电泳结果M：蛋白质Marker；A和B：1、2分别表示对照组pGEX-6p-1的未诱导与诱导的产物；3、5、7泳道为超声裂解细胞上清液，4、6、8泳道为超声裂解细胞上清液，箭头所指为诱导的重组菌pGEX-6p-ZmCen目的蛋白表达产物，其中仅在图A的7泳道中的上清中表达出45 kD可溶性的融合目的蛋白；C为0.3mmol/L IPTG诱导的不同体系上清中蛋白表达；D为诱导20 h的不同体系上清中蛋白表达Fig.3 The result of ZmCen protein expression on12%SDS-PAGEM was marker of protein standard molecular weight；A and B:1 and 2 were the expression of negative control,3,5 and 7 lanes were the expression of ZmCen protein in supernatant with IPTG induction.4,6 and 8 lanes were the expression of ZmCen protein in deposition with IPTG induction.The induced solvable GST fusion protein of 45 kD was only expression in lane 7 of Fig A;C: the expression protein under 0.3mmol/L IPTG induction condition;D:the expression protein under induction 20 h condition。

从图3中可以看出，图3A中的部分体系在泳道4的沉淀中出现了大量的目的蛋白，第7泳道中有较大量的目的蛋白表达，同时沉淀中的蛋白较少（第8泳道）。图3B不同体系的结果显示，在第4、第8泳道中表达出了目的蛋白，但也都是沉淀中的表达，基本都是以包涵体的形式存在，上清中仅有少量的或微量的可溶性蛋白表达，结果也不利用蛋白的进一步纯化。图3C为0.3mmol/L IPTG的诱导条件的电泳结果，从图可以看出，IPTG浓度相同条件下，诱导温度和诱导时间的不同，诱导的目的蛋白的表达量也不同，其中第7、8、10泳道的表达量较大。图3D为诱导时间在20 h条件下的蛋白表达结果，其中第7、9、10泳道的表达量较大。综合正交表达条件下的所有诱导结果分析，当IPTG浓度为0.3mmol/L，28℃时诱导20h时，确定为GST-ZmCen融合蛋白表达的最佳体系，其表达的目的蛋白位于沉淀中的目的蛋白极少，大部分是存在于上清中的可溶性蛋白，而其他条件下有的未表达出可溶性的目的蛋白，即要么以包涵体的形式，要么表达量不够。因此将此条件确定为诱导表达ZmCen的最适诱导条件。大量可溶性蛋白的成功诱导将为进一步用于的蛋白纯化及性质研究。

4　结论

构建的重组菌株pGEX-6p Zmcen-BL21，当诱导条件为0.3 mmol/L IPTG，温度为28℃，诱导20 h时，位于上清中的GST-ZmCen可溶性融合蛋白大量被诱导表达，被确定为最佳的诱导条件。这将为后续蛋白的分离纯化及性质研究提供一定的借鉴。

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（责任编辑铁军）

Lei Hai-ying1,Bai Feng-ling1,Wang Zhi-jun2
（1.Department of Biology Science&Technology,Changzhi University,Changzhi,Shanxi 046011; 2.Department of Chemistry,Changzhi University,Changzhi Shanxi 046011）

Q753

A

1673-2014（2016）02-0005-05

国家自然科学基金项目（21201024）；山西省自然科学基金项目（2012021009-1）；山西省科技攻关项目（20140311005-3）。

2016—01—13

雷海英（1978－)，女，山西平遥人，讲师，硕士，主要从事分子生物学教学与研究。