促卵泡素受体和促黄体素受体在乏情期和怀孕期牦牛卵巢中的表达

张　寿,吴威红,常　兰*,严作云,张靖维

(1.青海大学农牧学院，青海西宁 810016；2.青海省都兰县兽医站，青海都兰 816100)



促卵泡素受体和促黄体素受体在乏情期和怀孕期牦牛卵巢中的表达

张寿1,吴威红1,常兰1*,严作云2,张靖维2

(1.青海大学农牧学院，青海西宁 810016；2.青海省都兰县兽医站，青海都兰 816100)

应用免疫组织化学技术和图象分析方法对乏情期、怀孕期牦牛卵巢的促卵泡素受体(FSHR)、促黄体素受体(LHR)的表达特点进行了研究。结果表明，牦牛卵巢的皮质、髓质、颗粒层和膜内层、黄体中都分布有FSHR和LHR。且牦牛卵巢皮质、髓质中的FSHR光密度值在乏情期显著大于怀孕期(P<0.05)；怀孕期无黄体侧卵巢颗粒层和膜内层中FSHR光密度值均大于乏情期和怀孕期有黄体侧(P<0.05)。怀孕期有黄体侧卵巢皮质处LHR光密度值最大，乏情期次之，怀孕期无黄体侧最小，各组间差异显著(P<0.05)；在怀孕期无黄体侧卵巢髓质处LHR光密度值显著小于怀孕期有黄体侧和乏情期(P<0.05)；在乏情期、怀孕期无黄体侧和怀孕期有黄体卵巢颗粒层和膜内层处LHR光密度值之间差异均不显著(P>0.05)。表明牦牛卵巢中FSHR和LHR随着生殖阶段的不同而变化。

促卵泡素受体；促黄体素受体；卵巢；牦牛；免疫组织化学技术

垂体激素促卵泡素(follicle stimulating hormone，FSH) 、促黄体素(luteinizing hormone，LH)

的作用与卵巢、子宫上相应的激素受体紧密相关，二者可以直接作用于卵巢，调节卵泡细胞生长发育及排卵。由于FSH、LH为大分子蛋白质，不能透过细胞膜，需要通过卵巢上颗粒细胞的特异性受体——促卵泡素受体(FSHR)和促黄体素受体(LHR)介导[1]。近年来对动物卵巢、子宫中激素受体的研究较多[2-10]，但对于牦牛卵巢FSHR和LHR相关的研究相对较少。本试验对怀孕期和乏情期牦牛卵巢FSHR和LHR表达进行了研究，为深入探讨牦牛生殖内分泌特性和提高繁殖能力提供基础资料。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1试验用动物选取临床健康的青海省天峻县(平均海拔4 000 m)乏情期和怀孕4月～5月成年母牦牛各5头，年龄5岁～6岁。

1.1.2试剂内源性过氧化酶阻断剂(试剂A)、非免疫动物血清(试剂B)、生物素标记的羊抗兔IgG(试剂C)、链霉菌抗生素蛋白-过氧化酶(试剂D)，武汉博士德公司产品；兔源FSHR或者LHR多克隆抗体，武汉博士德公司产品。

1.2方法

1.2.1动物处理将选取的母牦牛各5头，放血致死，迅速取两侧卵巢，分别中央纵切为两半，置40 g/L多聚甲醛磷酸缓冲液固定。

1.2.2组织切片的制作及染色经梯度酒精脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋，切片，片厚4 μm，贴片，烤片，进行免疫组织化学染色,组织脱蜡至水，蒸馏水洗3次，每次3 min，再用0.01 mol/L PBS液(pH7.4)洗3次，每次8 min，以下各步之间均以0.01 mol/L PBS 液(pH7.4)充分洗涤；修复液高压修复2 min；用内源性过氧化酶阻断剂(试剂A)，37℃孵育20 min；加非免疫动物血清(试剂B)，37℃孵育45 min，不洗；加一抗(兔源FSHR或者LHR多克隆抗体，工作浓度均为1∶200)，4℃过夜；加生物素标记的羊抗兔IgG(试剂C)，37℃孵育2h；加链霉菌抗生素蛋白-过氧化酶(试剂D)，37℃孵育30 min；用DAB显色剂显色6 min，蒸馏水终止反应；苏木精染液复染、脱水、透明、封片。

1.2.3观察与数据统计在光学显微镜下400倍放大观察切片，每枚卵巢选3张切片，每组共15张，每张切片选6个微血管密度大、染色深的不重复视野，用图象采集系统采集图片，所采集的图片用IMAGE PRO PLUS 6.0软件(德国)进行累计光密度值的测定，每组累计光密度值中从大到小依次取60个数据进行平均光密度值(mean optical density，MOD)计算，所得数据用SPSS 17.0软件做统计学处理，结果均以均数±标准差表示，并对试验数据进行单因素方差分析并比较。

2　结果

2.1乏情期和怀孕期牦牛卵巢FSHR的分布

FSHR主要分布在牦牛卵巢的皮质、髓质、黄体以及卵泡颗粒层和膜内层中，卵母细胞的细胞质中也有分布，呈淡黄色。在乏情期卵巢皮质、髓质处FSHR多，怀孕期FSHR少；而在怀孕期无黄体侧卵泡颗粒层和膜内层处多、乏情期和怀孕期有黄体侧少，但黄体中也分布有FSHR(图1)。

2.2乏情期和怀孕期牦牛卵巢FSHR的表达变化

由表1可知，乏情期和怀孕期牦牛卵巢的皮质、髓质、黄体以及卵泡颗粒层和膜内层处的FSHR光密度值各不相同。在乏情期卵巢皮质和髓质中FSHR光密度值显著大于怀孕期有黄体侧卵巢和怀孕期无黄体侧的FSHR光密度值(P<0.05)，但后两者之间差异均不显著(P>0.05)。在怀孕期无黄体侧卵巢卵泡颗粒层和膜内层中FSHR光密度值显著大于乏情期卵巢和怀孕期有黄体侧卵巢FSHR光密度值(P<0.05)，而后两者之间差异不显著(P>0.05)。

2.3乏情期和怀孕期牦牛卵巢LHR的分布

LHR主要分布在乏情期和怀孕期牦牛卵巢的皮质、髓质、黄体以及颗粒层和膜内层中，卵母细胞的细胞质中也有分布，呈淡黄色。怀孕期有黄体侧卵巢髓质和乏情期、怀孕期无黄体侧、怀孕期有黄体侧卵巢的颗粒层和膜内层中LHR样着色较深。怀孕期有黄体侧卵巢的黄体中LHR样着色也较深(图2)。

2.4乏情期和怀孕期牦牛卵巢LHR的表达变化

由表2可知，乏情期和怀孕期牦牛卵巢的皮质、髓质、黄体以及卵泡颗粒层和膜内层处的LHR光密度值有所不同。其中，在怀孕期有黄体侧卵巢皮质处LHR光密度值最大，乏情期次之，怀孕期无黄体侧最小，且各组间差异显著(P<0.05)；在怀孕期无黄体侧卵巢髓质处LHR光密度值均显著少于怀孕期有黄体侧和乏情期(P<0.05)，而后两者之间差异不显著(P>0.05)；在乏情期、怀孕期无黄体侧和怀孕期有黄体组间卵泡卵巢颗粒层和膜内层处LHR光密度值差异均不显著(P>0.05)。

3　讨论

3.1FSHR免疫阳性细胞在牦牛卵巢中的分布特点与卵巢功能的关系

哺乳动物FSHR阳性细胞在卵巢中主要分布卵母细胞、颗粒细胞、各级卵泡以及卵泡膜中[3-5]。

A、B、C分别为乏情期、怀孕期无黄体侧和怀孕期有黄体侧的皮质；D、E、F分别为乏情期、怀孕期无黄体侧和怀孕期有黄体侧的髓质； G、H、I分别为乏情期、怀孕期无黄体侧和怀孕期有黄体侧的颗粒层和膜内层；J为黄体

A,B,C.Cortexes of anestrus,pregnancy(without corpus luteum),pregnancy(corpus luteum);D，E，F.Medullae of anestrus,pregnancy(without corpus luteum),pregnancy(corpus luteum);G，H，I.Stratum granulosum and theca interna of anestrus, pregnancy(without corpus luteum),pregnancy(corpus luteum);J.Corpus luteum

图1FSHR免疫反应产物在乏情期和怀孕期牦牛卵巢的分布(400×)

Fig.1Immunolocalization of FSHR in ovaries during anestrus and pregnacy of yaks(400×)

在水牛卵巢中，FSHR、LHR阳性细胞主要见于卵巢内膜上皮细胞、卵泡颗粒细胞，卵泡期FSHR、LHR的染色强度均高于黄体期[1]。本次研究的结果也表明牦牛卵巢中FSHR阳性细胞主要分布在具有大量原始卵泡的皮质部、各级卵泡的颗粒细胞层和内膜层中以及髓质当中，也有少量阳性细胞分布在黄体中。从FSHR光密度值可以看出，牦牛在乏情期卵巢皮质部的光密度值比怀孕期大，说明牦牛虽然处于乏情期阶段，但整个卵巢的发育仍需要FSH的调节，并且为发情期卵泡的迅速发育奠定了受体基础。而在怀孕期，由于受到黄体产生孕酮的抑制作用，卵巢皮质、髓质部的FSHR光密度值明显减少。据此，可以断定，乏情期牦牛卵巢对FSH的敏感性较强而怀孕期牦牛卵巢对FSH的敏感性较低。资料报道[11]卵泡在发育到初级、次级卵泡时FSHR阳性细胞主要分布于颗粒层和内膜层中，这有利于FSH与FSHR结合并产生信号，为卵泡提供物质交换和营养，促进其成熟。阳性细胞越多的卵泡受体效应越强，卵泡才有机会向优势卵泡发育。从本试验的光密度值可以看出，怀孕期无黄体侧卵泡颗粒层和内膜层的FSHR光密度值明显高于怀孕期有黄体侧和乏情期，这一现象提示牦牛卵泡的发育可能需要少量孕酮的刺激，而大量孕酮的刺激反而抑制卵泡的发育。

表1　FSHR免疫反应产物在乏情期和怀孕期牦牛卵巢的表达

注：同列角标不同字母表示差异显著(P<0.05)。

Note：The data with different letters in the same column mean significant difference(P<0.05).

A、B、C分别为乏情期、怀孕期无黄体侧和怀孕期有黄体侧的皮质；D、E、F分别为乏情期、怀孕期无黄体侧和怀孕期有黄体侧的髓质； G、H、I分别为乏情期、怀孕期无黄体侧和怀孕期有黄体侧的颗粒层和膜内层；J为黄体

A,B,C.Cortexes of anestrus, pregnancy(without corpus luteum),pregnancy(corpus luteum);D，E，F.Medullae of anestrus, pregnancy(without corpus luteum),pregnancy(corpus luteum);G，H，I.Stratum granulosum and theca interna of anestrus,pregnancy(without corpus luteum),pregnancy(corpus luteum);J.Corpus luteum

图2　LHR免疫反应产物在乏情期和怀孕期牦牛卵巢的分布(400×)

注：同列角标不同字母表示差异显著(P<0.05)。

Note：The data with different letters in the same column mean significant difference(P<0.05).

3.2LHR免疫阳性细胞在牦牛卵巢中的分布特点与卵巢功能的关系

研究表明[11]，LH在腔前卵泡发育过程中具有一定的作用，LHR在有腔卵泡的颗粒细胞和内膜细胞中就有表达，并且LHR在近成熟卵泡排卵过程中起着至关重要的作用。卵泡在晚期LHR表达最高，这与卵泡发育到后期对促性腺激素的依赖由FSH 转向LH是相适应的，说明在卵泡优势化过程中可能与颗粒细胞获得LHR和迎合LH峰到来有关。本次研究结果与以上资料报道基本相一致，乏情期牦牛卵巢的皮质、髓质以及有腔卵泡的颗粒细胞层、内膜层中都有LHR的表达，说明处于乏情期的牦牛卵巢卵泡虽然处于相对静止状态，但其功能的维持仍需要来自垂体LH的调节。结果还表明，处于怀孕期牦牛有黄体侧卵巢LHR的表达比无黄体侧强，说明有黄体侧卵巢接受LH调节作用的功能更强，这就更有利于黄体功能的维持和怀孕的进行。

[1]李成娇，朱晓玲，李万宏，等.促性腺激素受体在雌性水牛生殖器官的表达定位研究[J].中国畜牧兽医，2011，38(4):66-69.

[2]刘立文，张立永，穆秀明，等.日粮能量对育成柴鸡卵巢促卵泡素受体、促黄体素受体表达的影响[J].中国兽医学报，2014，34(6):1023-1027.

[3]龙威海，丁玫，冯文武，等.卵泡刺激激素素受体基因(FSHR)在贵州地方山羊多态性及表达研究[J].农业生物技术学报，2015，23(6):755-761.

[4]邵康，周杰，吴小雪，等.猪卵巢中脂联素受体与FSHR和CYP19基因表达的发育变化及其相关性研究[J].南京农业大学学报，2013，36(4):141-144.

[5]Chu M X,Guo X H,Feng C J,et al.Polymorphism of 5' regulatory region of ovine FSHR gene and its association with litter size in Small Tial Han sheep[J]. Mol Bio Rep,2012，39(4): 3721-3725.

[6]贾存灵，李宁，魏泽辉，等.不同BMPR基因型小尾寒羊同期发情处理后FSHR和LHR表达量的研究[J].中国农业科学，2006，39(1):170-175.

[7]Shaughnessyp J,Melelland D,Mebyide M W.Regulation of luteinizing hormone-receptor and follicle-stimulating hormone-receptor messenger ribonucleic acid levels during development in the neofatal mouse ovary[J].Biol Reprod, 1997，57(3): 602-608.

[8]李雯，罗虹，柴志欣，等.牦牛FSHR基因5′ 端部分序列克隆及生物信息学分析[J].家畜生态学报，2014，35(1):15-20.

[9]周立花，李汶，卢光琇.FSHR、LHR基因突变与多态性对女性生殖的影响[J].现代生物医学进展，2010，10(1):186-189.

[10]李泰云，韩小康，丁彦红，等.沂蒙黑山羊发情周期不同阶段卵巢中FSHR和LHR基因表达规律的研究[J].中国兽医科学，2011, 41(9):954-959.

[11]蒋香菊.绵羊卵泡发育中AMH、FSHR、LHR基因的表达特征分析[D].新疆石河子：石河子大学，2014.

Expression of Follicle Stimulating Hormone Receptor and Luteinizing Hormone Receptor in Yak Ovaries During Anestrus and Pregnancy

ZHANG Shou1, WU Wei-hong1,CHANG Lan1,YAN Zuo-yun2, ZHANG Jing-wei2

(1.College of Agriculture and Animal Husbandry,Qinghai University,Xining,Qinghai,810016,China;2.DulanCountyVeterinaryStation,Dulan,Qinghai,816100,China)

The expression characteristics of follicle stimulating hormone receptor and luteinizing hormone receptor in yak ovaries during the anestrus and pregnancy were investigated by immunohistochemical technique and the section image software analysis techniques.The results showed that FSHR and LHR are mainly distributed in cortex,medulla,stratum granulosum and theca interna,corpus luteum of ovaries.In cortex and medulla,the FSHR mean optical densities of yak ovaries during anestrus were significantly greater than those during pregnancy(P<0.05),respectively;in stratum granulosum and theca interna,FSHR mean optical densities of yak ovaries without corpus luteum during pregnancy were significantly greater than those during anestrus between the 3 groups(P<0.05); In medulla,LHR mean optical density of yak ovary without corpus luteum during pregnancy were significantly smaller than those with corpus luteum during pregnancy (P<0.05),respectively.In cortex,the LHR mean optical density of yak ovaries with corpus luteum during pregnancy was the largest and that of yak ovaries without corpus luteum during pregnancy was the smallest among 3 groups,there were significant luteum during pregnancy and anestrus(P<0.05);in stratum granulosum and theca interna,the LHR mean optical densities of yak ovaries were no significant difference between the 3 groups(P>0.05).The results indicated that FSHR and LHR in yak ovaries varied with the reproductive phases.

follicle stimulating hormone receptor;luteinizing hormone receptor;ovary; yak;immunohistochemical technique

2016-01-31

国家自然科学基金项目(31360590)；青海省科技应用基础项目(2014-ZJ-711)

张寿(1964-)男，青海西宁人，教授，主要从事高原动物低氧适应和繁殖研究。*通讯作者

S852.21

A

1007-5038(2016)09-0070-05