两株不同致病力H9N2亚型禽流感病毒反向遗传操作系统的构建

范丹丹,张　毅,刘琳琳,王冬冬,王建琳,徐守振，毕玉海，尹燕博*

(1.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109；2.中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛 266032；3.丹阳市动物疫病预防控制中心，江苏丹阳 212300；4.中国科学院微生物研究所,北京 100101)



两株不同致病力H9N2亚型禽流感病毒反向遗传操作系统的构建

范丹丹1△,张毅2△,刘琳琳3,王冬冬1,王建琳1,徐守振1，毕玉海4，尹燕博1*

(1.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109；2.中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛 266032；3.丹阳市动物疫病预防控制中心，江苏丹阳 212300；4.中国科学院微生物研究所,北京 100101)

为研究H9N2亚型禽流感病毒毒株对禽类致病性的分子致病机制，选用A/chicken/Shandong/818/2010和A/chicken/Shandong/196/2011 两株致病力存在明显差异的野生型H9N2亚型禽流感病毒，用RT-PCR扩增其全基因组序列，并将其全部克隆于PHW2000双向转录/表达载体。经测序验证后，将其转入293T细胞，并拯救出2株具有血凝活性的毒株。对拯救毒株进行全基因组测序验证后，结果表明拯救出的毒株与2株野生型病毒的核苷酸序列完全一致；体外试验证明，拯救毒株与野生毒株在鸡胚和细胞中的复制能力一致；动物试验证明，拯救毒株保持了野生型毒株对鸡和鸡胚的致病力。这两套反向遗传操作系统的构建，研究了病毒变异规律，发现了可能导致H9N2亚型禽流感病毒增强的关键氨基酸位点，为流感的监测及预防提供依据。

H9N2亚型禽流感病毒；强致病性；反向遗传；感染性克隆

1994年陈伯伦等[1]首次从我国广东某鸡场发病鸡的体内分离到H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)。香港大学和中国农业科学院哈尔滨兽医研究所等单位发表的监测数据显示，H9N2亚型禽流感病毒在我国(特别是南方地区)持续流行，且宿主范围广泛，包括鸡、鸭、珍珠鸡、鹌鹑等[2-4]。近年来，在我国部分商品产蛋鸡场及养鸡专业村的流感调查中发现，H9N2亚型禽流感病毒抗体阳性鸡群占总的流感病毒抗体阳性鸡群的93.67%，说明H9N2亚型AIV在鸡群中广泛存在[5]。H9N2亚型AIV为低致病性禽流感病毒，在早期的研究中，试验条件下接种SPF鸡，一般不表现明显的临床症状[6]。在养殖环境下，鸡感染H9N2亚型AIV会产生呼吸困难、腹泻、产蛋下降等症状，当继发细菌感染时可引起一定的死亡[7-9]。近些年来，根据本实验室对临床分离的H9N2亚型毒株研究发现，部分分离株对鸡和鸡胚的致病性显著增强。强致病力毒株在鸡体内复制力强、排毒时间长，可以造成鸡系统性感染，接种鸡胚后，鸡胚平均死亡时间(mean death time,MDT)显著小于一般的H9N2毒株[10]。

为研究H9N2亚型毒株致病力增强的分子机制，本研究对2007年—2013年分离的部分H9N2亚型毒株进行了全基因组测定，并根据致病力试验的结果，选择了一对致病力存在明显差异，且基因组差异相对较小的毒株。用RT-PCR扩增2株H9N2亚型病毒的8个基因全长片段,克隆入双向转录/表达载体PHW2000。将8个质粒转染293T细胞后，均拯救出了预期组合、有感染性的H9N2亚型流感病毒。这两套H9N2亚型反向遗传操作系统的建立，为基因功能、结构及与宿主细胞相互作用的研究奠定了坚实的基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1病毒A/chicken/Shandong/818/2010(SD/818)分离自山东某鸡场，据世界动物卫生组织(OIE)指定方法测定其MDT为60.5 h，IVPI为0.63；A/chicken/Shandong//2011(SD/196)分离自山东某活禽市场，其MDT为96.3 h，IVPI为0。

1.1.2试剂RNeasy Plus RNA提取试剂盒、Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit、DH5α感受态细胞，宝生物工程(大连)有限公司产品；Trans5K DNA Marker，北京全式金公司产品；限制性内切酶BsmBⅠ、BsaⅠ、T4连接酶，NEB公司产品；DMEM(含有L-谷氨酰胺、丙酮酸钠)细胞培养液，HyClone公司产品；澳洲胎牛血清、PBS缓冲液、双抗、2.5 g/L Trypsin-EDTA、Opti-MEM基础培养液，Gioco公司产品；Lipofectmine 2000转染试剂,Invitrogen公司产品；TPCK-Trypsin，Sigma公司产品。

1.2方法

1.2.1禽流感病毒目的基因片段的扩增对收集的尿囊液按照RNeasy Plus RNA提取试剂盒说明书进行病毒总RNA的提取，并加入20 μL无RNA酶水溶解RNA。采用Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit，对病毒基因组RNA模板进行RT-PCR。RT-PCR所用引物均参考Hoffmann E等报道[11]。

1.2.2反向遗传操作系统质粒的构建用BsmBⅠ或BsaⅠ酶切PHW2000载体质粒，用BsaⅠ酶切病毒PB2和NA基因片段，用BsmBⅠ酶切PB1、PA、HA、NP、M、NS基因片段，利用T4连接酶连接PHW2000载体和目的基因片段。将连接好的载体转入DH5α感受态细胞，并筛选其中的阳性克隆，送北京六合华大基因技术服务公司测序，以确保阳性克隆序列的正确性。用去内毒素质粒提取试剂盒提取阳性克隆质粒并利用核酸定量仪进行质粒定量。

1.2.3病毒的拯救

1.2.3.1细胞的准备将293T细胞和MDCK细胞按照5∶1的比例铺于6孔细胞板，铺板后18 h～24 h进行转染，此时细胞85%左右融合。进行转染前用PBS缓冲液轻轻洗2次细胞。

1.2.3.2混合质粒将流感病毒8个基因片段质粒各500 ng加入1.5 mL离心管中。

1.2.3.3转染加入200 μL Opti-MEM培养基(无血清、无抗生素)于已加入质粒的1.5 mL离心管中→加入10 μL Lipofectmine 2000转染试剂→瞬时离心以混匀→室温放置45 min→加入200 μL Opti-MEM培养基于离心管中；吸净6孔板中的细胞液，用PBS缓冲液洗2次后，吸净残余的PBS；将1.5 mL离心管中的液体全部移入孔中，37 ℃培养6 h；加入含有2 μg/mL TPCK-胰酶的Opti-MEM培养基于6孔板中，1 mL/孔，37℃培养48 h～72 h后，置于-80 ℃保存备用。

1.2.4拯救病毒的增殖及鉴定

1.2.4.1增殖将转染后冻存的细胞液从-80 ℃冰箱取出，待其融化后吹打混匀细胞液，接种于10日龄SPF鸡胚，于37 ℃孵育72 h，收获尿囊液，测定其凝集红细胞的活性。若无血凝活性，则盲传一代，放弃仍无血凝性的样本。

1.2.4.2鉴定对拯救的病毒进行全基因组序列测定，然后通过与两亲本病毒基因组的比较来判定拯救的病毒的正确性。引物序列及病毒RNA提取、片段扩增和测序的方法同1.2.1。

1.2.5病毒复制力的测定参照Zhang Y等[12]报道的方法,测定并绘制拯救病毒和野生型病毒在MDCK细胞上的生长曲线；分别以106EID50剂量的拯救病毒和野生型病毒平行接种9枚鸡胚，在接种后6、12、24、48 h，分别取3枚鸡胚，测定其EID50，取平均数代表病毒在该时间点的复制情况，并绘制复制曲线。

1.2.6病毒对鸡胚和鸡致病力的测定按照OIE手册介绍的方法，分别测定野生型和拯救毒株的鸡胚平均死亡时间(MDT)和静脉致病指数(IVPI)，以此来比较病毒对鸡胚和鸡的致病力。MDT测定方法为将收获的尿囊液进行10倍比稀释，接种10日龄SPF鸡胚，连续观察7 d，计算引起所有鸡胚死亡的最大稀释度使鸡胚死亡的平均时间。IVPI的测定方法为将收获的尿囊液10倍稀释静脉接种于6周龄SPF鸡，观察10 d并记分，正常鸡记作0，病鸡记作1，严重感染记作2，死亡鸡记作3，计算10 d内每日观察记录的平均值。

2　结果

2.1重组质粒的构建

提取病毒的RNA，进行反转录反应，然后用带有酶切位点的流感病毒通用引物进行PCR扩增，酶切后连入PHW2000载体，经筛选和PCR鉴定呈阳性，且目的条带大小与预期一致的克隆，进行序列测定，测序结果证明构建的重组质粒所携带的目的基因序列，与原病毒基因序列完全一致(图1)。

2.2病毒的拯救

通过转染试剂，将构建好的重组质粒转入已准备好的293T细胞。细胞液接种鸡胚48 h～72 h后，收获尿囊液，测定血凝活性，血凝活性均大于26，经血凝抑制试验鉴定，获得的毒株为H9N2亚型禽流感病毒。提取RNA，反转录，经PCR扩增，测定其序列，与原病毒序列进行比对，结果证实拯救获得的病毒基因序列与原病毒序列完全一致。

2.3病毒的复制能力

2.3.1病毒在鸡胚中的复制能力的测定分别将SD/818和拯救获得的rSD/818，SD/196和rSD/196接种SPF鸡胚，然后在不同的时间点收获尿囊液，测定病毒滴度，比较野生毒株和拯救毒株在鸡胚中的复制能力。结果显示，野生型毒株SD/818与其拯救株rSD/818在各个时间点的复制情况基本一致。SD/196和rSD/196的复制情况也无显著差异。然而在感染病毒后24、48 h，SD/818和rSD/818均比SD/196和rSD/196高约1个log10EID50/mL(图2)。

A.SD/196；B.SD /818

1.PB2;2.PB1;3.PA;4.HA;5.NP;6.NA;7.M;8.NS;9.DNA 标准DL 5 000

1.PB2;2.PB1;3.PA;4.HA;5.NP;6.NA;7.M;8.NS;9.DNA Marker DL 5 000

图1质粒鉴定结果

Fig.1The results of plasmid identification

2.3.2病毒在MDCK细胞中的复制能力分别将野生型毒株和拯救获得的毒株接种MDCK细胞后，在不同的时间点收获细胞上清液，测定病毒的增殖情况(图3)。结果显示，2株病毒的野生型毒株和拯救毒株之间的复制情况基本一致，且两组病毒间在MDCK细胞上的复制情况也无显著差异。

2.4病毒对鸡胚的致病力

将拯救获得的毒株接种SPF鸡胚，测得其MDT值(表1)，以此衡量病毒对鸡胚的致病力。结果表明，SD/818与rSD/818的MDT无有显著差异，SD/196与rSD/196的MDT也无显著差异。证明拯救株相比野生型毒株，对鸡胚的致病力未发生改变。

2.5病毒对SPF鸡的致病力

将拯救的病毒静脉接种SFP鸡，观察10 d，记录发病和死亡情况，测得毒株的IVPI(表1)，以此衡量毒株对鸡的致病力。结果证实，2株拯救获得的毒株与野生型毒株相比，其IVPI未发生显著变化，证明其对鸡的致病力未发生变化。

3　讨论

H9N2亚型禽流感病毒在我国流行十分广泛，对我国的肉鸡养殖业造成巨大的危害。近些年来，在对病原的监测中，发现部分H9N2亚型禽流感毒株可以在72 h内致死鸡胚，部分毒株甚至可以在48 h内致死鸡胚[13-15]。接种SPF鸡后，发现这些毒株对鸡呈现比较强的致病力，IVPI比2007年分离到的H9N2毒株显著提高。本研究在以往临床调查和实验室研究的基础上，选择致病性不同而基因组相似的H9N2亚型禽流感病毒为研究对象，应用生物信息学和反向遗传学等技术，探讨影响H9N2亚型流感病毒复制力和致病力的关键氨基酸位点，评价这些关键氨基酸位点对病毒组织嗜性、复制能力等影响，解析H9N2亚型禽流感病毒对鸡致病力增强的分子机制。

图2　H9N2野生型毒株与拯救毒株在鸡胚中的复制情况Fig.2　The replication ability of H9N2 AIV field virus and rescued virus in chicken embryos

图3　H9N2野生型毒株与拯救毒株在MDCK 细胞上中的复制情况Fig.3　The replication ability of H9N2 AIV field virus and rescued virus in MDCK cells表1　H9N2亚型野生型毒株和拯救毒株对鸡胚 和SPF鸡的致病力Table 1　Virulence of field virus and rescued virus in SPF chickens and chicken embryos

毒株Virus最小致死量的鸡胚死亡时间/hMDT静脉接种指数IVPISD/81860.50.63rSD/81862.50.60SD/19696.30rSD/19693.50

目前，关于H9N2亚型AIV感染力和致病力的分子机制的研究仍不够深入，反向遗传操作系统提供了一个可以从分子水平研究流感病毒致病性、种间传播能力、病毒变异机制的平台和基础[16-17]。SD/818和SD/196病毒株反向遗传系统的建立是研究H9N2亚型AIV的第一步，可以通过定点突变深入研究决定H9N2亚型AIV致病力及传播能力的关键基因及位点，探索H9N2亚型AIV致病的分子基础及跨种传播的分子基础，为预测流感的大流行提供依据。

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Establishment of Reverse Genetics System for Two Different Virulences of H9N2 Subtype Avian Influenza Virus

FAN Dan-dan1△,ZHANG Yi2△，LIU Lin-lin3,WANG Dong-dong1,WANG Jian-lin1,XU Shou-zhen1,BI Yu-hai4,YIN Yan-bo1

(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine,Qingdao Agricultural University,Qingdao,Shandong,266019,China;2.ChinaAnimalHealthandEpidemiologyCenter,Qingdao,Shandong,266032,China;3.DanyangPreventionandControlCenterofAnimalDisease,Danyang,Jiangsu,212300,China;4.InstituteofMicrobiology,ChineseAcademyofSciences,Beijing,100101China)

In order to obtain two stains of rescued H9N2 viruses,which showed different virulences to chickens,two sets of eight plasmid system were established.The rescued virus was generated by reserve genetic technique.The full genome of rescued virus was sequenced,and the results showed the rescued virus carried 100% homogeny whth their wild type.Theinvitroexperiment indicated the rescued virus carried identical replication ability in chicken embryos and MDCK celsl.The animal experimentinvivoshowed the virus maintained the same pathogenicity to embryos and SPF chickens.The above experiments proved the reverse genetic operating systems were established,which laid a solid foundation for researching the molecular mechanism of pathogenicity of H9N2 influenza virus.

H9N2 subtype avian influenza virus;higher pathogenicity;reverse genetics;infectious clone

2016-03-01

国家自然科学基金项目(31272535)；山东省现代农业产业技术体系家禽创新团队建设项目(№SDAIT-13-011-03)

范丹丹(1990-)，女，山东枣庄人，硕士，兽医师，主要从事预防兽医学研究。张毅(1983-)，男，山西定襄人，博士，主要从事兽医流行病学研究。△同等贡献作者。*通讯作者

S852.659.5

A

1007-5038(2016)09-0005-05