广西H9亚型禽流感病毒的分离鉴定和生物学特性研究

徐　倩，谢芝勋，罗思思，谢丽基，邓显文，谢志勤，黄　莉，黄娇玲，张艳芳，曾婷婷，王　盛

(1.广西大学动物科技学院，广西南宁530001；2.广西壮族自治区兽医研究所/广西动物疫病病原生物学与诊断重点实验室， 广西南宁 530001)



广西H9亚型禽流感病毒的分离鉴定和生物学特性研究

徐倩1，谢芝勋2*，罗思思2，谢丽基2，邓显文2，谢志勤2，黄莉2，黄娇玲2，张艳芳2，曾婷婷2，王盛2

(1.广西大学动物科技学院，广西南宁530001；2.广西壮族自治区兽医研究所/广西动物疫病病原生物学与诊断重点实验室， 广西南宁 530001)

通过对2011年—2014年从广西不同地区的活禽市场、养鸡场、野生鸟类保护区等地采集的咽喉腔及泄殖腔拭子进行病毒分离，用血凝及血凝抑制试验初步鉴定出含H9亚型禽流感病毒的样品，对其进行纯化得到17株H9亚型禽流感病毒，用针对H9亚型禽流感病毒HA基因、N2亚型禽流感病毒NA基因的特异性引物对分离株进行RT-PCR扩增，分别获得特异性目的片段后进行测序分析，结果显示所有分离株经鉴定均为H9N2亚型禽流感病毒。对所有分离株的生物学特性进行研究，发现17株H9亚型禽流感病毒分离株均符合低致病禽流感病毒的特点，其中16株分离株通过受体亲和特性测定证明具有SAα2,3及SAα2,6两种受体结合特性，提示具有感染哺乳动物的潜能。

H9亚型禽流感病毒；分离；纯化；生物学特性

正黏病毒科(Orthomyxoviridae)A型流感病毒属流感病毒，根据其表面蛋白血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(nueraminidase，NA)抗原性的差异，目前已被鉴定出18个HA亚型(H1～H18)和11个NA亚型(N1～N11)[1-3]，其中16种HA亚型(H1～H16)以及9种NA亚型(N1～N9)都可以从禽类分离到[4]。可根据禽流感病毒(Avian influenza A virus,AIV)对鸡的致病力的不同而被分为高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV)和低致病性禽流感病毒(lowly pathogenic avian influenza virus，LPAIV)[5]。H9亚型AIV属于LPAIV，多数携带该病毒的野禽、水禽、家禽并不表现出临床症状或仅表现轻微临床症状，但越来越多的研究表明H9亚型AIV在我国大范围普遍存在，一旦出现临床症状多表现为呼吸系统症状、蛋鸡产蛋下降、肉鸡生长迟缓等，是影响我国养禽业发展的重要病原。不仅如此，如果H9亚型AIV与其他病原混合感染则可能引发更严重的疾病,如其与不同亚型的AIV混合感染则可能会在宿主体内发生基因片段重组[6]，从而产生不可预知的新型流感病毒，进而可能引起大流行。特别是20世纪90年代末以来发生的多起H9N2亚型AIV感染人的事件，以及2013年初引起人感染H7N9亚型AIV经基因来源分析发现，其6个内部基因均来自H9N2亚型禽流感病毒[7]。目前，H9N2亚型AIV引起广泛的关注，其公共卫生意义更加凸显。

本研究对2011年—2014年从广西不同地区的活禽市场、养鸡场、野生鸟类保护区等地采集的禽类咽喉及泄殖腔拭子进行禽流感病毒的分离鉴定，并对分离株进行生物学特性研究，分析其潜在致病力及流行情况，旨在为H9亚型禽流感的防控与研究提供参考依据及基础材料。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1样品 2011年—2014年从广西地区各活禽市场、养鸡场、野生鸟类保护区等采集禽类咽喉及泄殖腔拭子共计2 496份。

1.1.2标准阳性血清与10 mL/L鸡血红细胞 抗H1、H2、H3、H4、H6、H8、H10、H11、H12、H13亚型AIV阳性血清由广西壮族自治区动物疫病病原生物学与诊断重点实验室制备；抗H5、H7、H9亚型AIV及抗新城疫病毒(NDV)阳性血清,购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所；10 mL/L鸡血红细胞参照文献[8]制备。

1.1.3SPF鸡胚与SPF鸡 SPF鸡胚购自北京梅里亚公司；SPF鸡由所购鸡胚无菌孵化而得。

1.1.4主要试剂 RNA 提取Trizol Reagent 试剂,Invitrogen公司产品；反转录试剂、pMD18-T vector，宝生物(大连)工程有限公司产品；2×TransTaqHiFi PCR SuperMixⅡ，北京全式金公司产品；DNA Gel Extraction Kit，Axygen公司产品；3′-Sialyllactose-PAA-biotin(3′SL-PAA)和6′-Sialyllactose-PAA-biotin(6′SL-PAA)GlycoTech公司产品；链霉亲和素-辣根过氧化物酶(Streptavidin-HRP)、底物溶液，美国R&D systems公司产品。

1.1.5引物 反转录引物参照文献[9]、RT-PCR鉴定扩增引物参照文献[10]，引物均由北京六合华大基因科技有限公司合成，并以重蒸水稀释至25 μmol/L，于-20℃保存待用。

1.2方法

1.2.1病毒分离与初步鉴定

1.2.1.1样品的处理将采集的咽喉腔及泄殖腔拭子于pH7.2四抗(青霉素10 000单位/mL、链霉素10 mg/mL、庆大霉素50 μg/mL、制霉菌素25 μg/mL)PBS缓冲液充分捻转、挤压，保留液体部分，8 000 r/min离心10 min后收集上清，按照0.2 mL/枚的剂量接种5枚9日龄～11日龄SPF鸡胚，收集24 h后自然死亡鸡胚的尿囊液。将HA效价高于16个单位的尿囊液保存至-70℃备用；将HA效价低于16个单位的尿囊液继续接种9日龄～11日龄SPF鸡胚直至HA效价高于16个单位后保存。

1.2.1.2病毒HA亚型的血清学鉴定 参照《高致病性禽流感诊断技术》国家标准中血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验技术的方法，对所分离病毒进行HA亚型血清学鉴定。将对抗H9阳性血清的HI效价大于或等于5log2的病毒进行纯化或传代。

1.2.2病毒的纯化 采用鸡胚有限终点稀释结合特异性血清中和的方法[11-12]纯化所分离的H9亚型AIV，每传一代鸡胚即用HI鉴定纯化结果，直至连续2代所分离病毒对抗H9阳性血清的HI效价大于或等于5log2，且对其他亚型AIV阳性血清及新城疫阳性血清的HI效价小于等于3log2。

1.2.3分离株基因亚型的分子生物学鉴定参照Trizol Reagent 试剂使用说明书及文献[13]中所介绍的方法，对所分离病毒感染SPF鸡胚所收集的尿囊液进行RNA抽提，产物用33 μL DEPC处理水重悬；加入1.5 μL 反转录引物后70℃作用10 min；加入反转录体系： 5×AMV buffer 10 μL、dNTP(10 mmol/L)4 μL、RNA酶抑制剂 0.5 μL、AMV 1 μL,42℃作用90 min，制成cDNA。用文献[10]所建立的方法对所有分离株的HA和NA基因进行PCR扩增，并回收目的片段送至Invitrogen公司测序。

1.2.4分离株的命名 按照流感病毒国际命名法则(即：型别/宿主来源/地域来源/毒株序号/分离年代)对纯化并鉴定的分离株命名。

1.2.5分离株生物学特性测定

1.2.5.1鸡胚半数致死量(ELD50)和鸡胚半数感染量(EID50)测定 将分离纯化所得H9亚型AIV尿囊液用pH7.2四抗PBS缓冲液倍比稀释为10-5～10-106个梯度，每个梯度稀释液按照0.2 mL/枚的剂量接种5枚9日龄～11日龄SPF鸡胚，置于35℃孵育120 h。记录每个稀释度在24 h～120 h致死鸡胚数量，并收集接种后存活24 h以上的所有鸡胚尿囊液，分别测定其HA效价。按照Reed-Muench方法计算各分离株的ELD50和EID50。

1.2.5.2SPF鸡致病性及排毒期试验 将分离纯化的H9亚型AIV感染SPF鸡胚所得新鲜尿囊液用无菌PBS缓冲液稀释，分别以106EID50/只的剂量滴鼻攻毒5只6周龄SPF鸡，并设空白对照5只，观察14 d。分别于采集攻毒后第1、3、5、7、10、14天采集每只鸡的咽喉腔及泄殖腔棉拭子，用SPF鸡胚分离的方法检测排毒，HA效价大于或等于4log2即判为排毒，否则判为不排毒。

1.2.5.3分离株受体亲和特性测定 用PBS缓冲液将所分离病毒尿囊液稀释至7log2～9log2，每个分离株以100 μL/孔包被于96孔板每排12个孔，共2排，4℃包被过夜，以PBS缓冲液作空白对照；每孔加入10 g/L BSA封闭，室温作用2 h后PBST洗板4次；3′SL-PAA和6′SL-PAA分别设0.5、1、3、5 μg/mL 4个梯度以100 μL/孔加入反应孔，每个梯度重复3次共12个孔，空白对照分别加入1 mmol/L 3′SL-PAA和6′SL-PAA各100 μL，4℃作用2 h，PBST洗板4次；以1∶600剂量加入Streptavidin-HRP100 μL /孔，室温避光作用2 h，PBST洗板4次；底物溶液显色15 min～30 min后加1 mol/L H2SO4终止反应。读取OD 450 nm值。

2　结果

2.1病毒的分离与纯化

通过对采集到的咽喉及泄殖腔拭子样品进行病毒分离、HI试验，保留了将对抗H9亚型AIV阳性血清HI效价大于或等于5log2的病毒，并通过鸡胚有限终点稀释结合特异性血清中和的方法纯化所分离到的病毒，得到了连续2代对抗H9亚型AIV阳性血清的HI效价大于或等于5log2，且对其他亚型AIV阳性血清及新城疫阳性血清的HI效价小于等于3log2的H9亚型AIV毒株共17株(所有分离株传代次数不超过6代)。

2.2分离株基因亚型的分子生物学鉴定

对17个分离株cDNA进行PCR扩增后的凝胶电泳结果见图1，均与文献[10]所描述对H9N2亚型AIV扩增结果相一致。将扩增产物进行回收、克隆及测序后，测序结果与GenBank中AIV核酸序列进行Blast比对，所得HA基因序列片段与H9亚型AIV的HA基因序列同源性最高；所得NA基因序列片段与N2亚型AIV的NA基因序列同源性最高。以上两个结果均可鉴定17个分离株为H9N2亚型AIV，对这17株病毒进行标准命名(表1)。

M.DNA 标准DL 2 000;1～17.17株H9亚型AIV RT-PCR扩增产物

M.DNA Marker DL 2 000;1-17.The products of RT-PCR of 17 strains of H9 subtype AIVs

图1　H9亚型禽流感病毒分离株的RT-PCR鉴定

2.3分离株生物学特性的测定

2.3.1鸡胚半数致死量(ELD50)与鸡胚半数感染量(EID50)测定17个分离株的ELD50和EID50结果见表2。

表2　17个H9亚型AIV广西分离株的ELD50和EID50

2.3.2SPF鸡致病性试验所有分离株以106EID50滴鼻感染6周龄SPF鸡后，所有鸡只均未发病，对试验组与对照组进行临床观察未发现任何区别，说明17个H9亚型AIV分离株人工感染SPF鸡均呈隐性感染，临床不发病。17个分离株在攻毒后第1、3、5、7、10、14天，采集咽喉腔及泄殖腔拭子的鸡胚病毒分离情况见表3，所有毒株在攻毒后第1、3、5天均全部出现排毒，第14天均再检测不到排毒。

2.3.3分离株受体亲和特性测定受体亲和特性测定固相酶联试验结果见图2，以PBS缓冲溶液作阴性对照成立，除SR/GX/35B15/13株仅具有SAα2,3亲和特性外，其余16株分离株均具有SAα2,3和SAα2,6两种亲和特性，其中对SAα2,3的结合能力较高。

3　讨论

H9亚型禽流感病毒虽对感染禽的致病率低，但可引起呼吸系统症状、蛋鸡产蛋下降、肉鸡生长迟缓等，因而在普遍存在复合感染的情况下，对养禽业造成严重的经济损失。AIV可感染很多种野鸟、水禽以及家禽，尤其是自由飞翔的水栖鸟类。水禽和野鸟是基因重组病毒主要的基因供体库。由水禽提供基因，然后在完成病毒重组后传给鸡等陆生家禽，病毒再从陆生家禽回传到水禽，即形成双向传播。

表3　攻毒后排毒检测

广西地区的养禽业是许多地方的支柱产业，禽源种类丰富，活禽市场交易以及野生鸟类迁徙等都给H9亚型禽流感病毒的传播流行提供了便利，因此，对H9亚型禽流感病毒进行病原监测对于了解该病毒流行情况、掌握该地区流行株的生物特性，对于有效控制H9亚型禽流感的发生和流行具有十分重大的意义。

本研究对广西不同地区、不同时间的不同品种家禽甚至野禽进行了H9亚型AIV的病原学检测，分离纯化出17株H9亚型AIV，全部为H9N2亚型。通过研究我们发现，虽然多数家禽、野禽并未表现出任何的临床症状，但是这些健康禽群的H9亚型AIV的携带率相当高，无法排除这些病毒在传播过程中发生基因重组和突变而产生新型病毒或者毒力加强的可能，其潜在危险不可小觑。通过对分离株的毒力测定及致病性试验发现，部分从发病禽群分离到的H9亚型AIV在实验室人工感染SPF鸡的情况下，并未出现任何临床症状，这可能是因为家禽实地饲养环境与实验室环境相比较为复杂，存在混合感染导致发病的可能。

血凝素和细胞上受体类型的差异，是影响病毒宿主范围的主要因素。在以往的研究中有人认为，流感病毒受体主要有两种类型，即sialic acid-alpha-2,3-terminal saccharides(SAα2,3受体，禽型受体)和sialic acid-alpha-2,6-terminal saccharides (SAα2,6受体，人型受体)。禽流感病毒偏嗜前者，人流感病毒偏嗜后者[14-15]。但是本研究从受体亲和特性试验的结果来看，17株H9亚型AIV广西分离株中，除了1株(SR/GX/35B15/13)明显优先结合了SAα2,3受体，其余16株均表现出SAα2,3和SAα2,6两种受体亲和特性，表明这些毒株存在跨越种间屏障而感染人类的威胁，值得我们关注和警惕。

图2　H9亚型AIV受体亲和特性测定结果Fig.2　The determined results of receptor binding of H9 subtype AIVs

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Isolation,Identification and Biological Characteristics of H9 Subtype Avian Influenza Viruses

XU Qian1,XIE Zhi-xun2,LUO Si-si2,XIE Li-ji2,DENG Xian-wen2,XIE Zhi-qin2,HUANG Li2,HUANG Jiao-ling2,ZHANG Yan-fang2,ZENG Ting-ting2,WANG Sheng2,

(1.College of Animal Science and Technology,Guangxi University,Nanning，Guangxi，530004,China;2.Guangxi VeterinaryResearchInstitute,GuangxiKeyLaboratoryofAnimalEpidemicEtiologyandDiagnostic,Nanning,Guangxi,530001,China)

Influenza A viruses were isolated from throat and cloacal swabs collected in live poultry markets,poultry farms and wild birds reserves in Guangxi province from 2011 to 2014.17 strains were identified as H9 subtype influenza viruses (AIV) by HA and HI tests.Purified HA and NA genes of H9 AIVs were amplified by RT-PCR and sequenced.The 17 strains of H9 AIVs were identified into H9N2 subtype and lowly pathogenic strainsaccording to the nucleotide sequences and biological characteristics.16 strains were inclined to combine with both SAα2,3 and SAα2,6 influenza A virus receptors which indicated the threat of infection in mammals.

H9 subtype AIV；isolation；purification；biological characteristics

2016-02-29

广西自然科学基金项目(2013GXNSFDA019015)；桂渔牧科(201204930，201452001)；桂科专项(14-1)

徐倩(1987-)，女，河北石家庄人，硕士研究生，主要从事兽医生物技术研究。*通讯作者

S852.659.5

A

1007-5038(2016)09-0010-06