不同提取方法对植物粗提物抑制荔枝霜疫霉效果的影响

曾令达，黄 颖，曾海泉，尹 艳，宋冠华（.惠州学院生命科学系，广东 惠州 56007；2.惠州学院生物技术研究所，广东 惠州 56007；.惠州市农业科学研究所，广东 惠州 5602）

不同提取方法对植物粗提物抑制荔枝霜疫霉效果的影响

曾令达1，2，黄 颖1，曾海泉3，尹 艳1，2，宋冠华1，2
（1.惠州学院生命科学系，广东 惠州 516007；2.惠州学院生物技术研究所，广东 惠州 516007；3.惠州市农业科学研究所，广东 惠州 516023）

采用浸泡提取法和超声波提取法制备8种植物的粗提物，以菌丝生长法和孢子囊萌发法测定抑荔枝霜疫霉（Peronophythora litchi）的活性，并对黄柏（Cortex phellodendri）粗提物的抑菌活性进行初步研究。结果显示，植物粗提物对荔枝霜疫霉菌丝生长和孢子囊萌发抑制作用中，超声波提取法优于浸泡提取法，两种方法制备的黄柏粗提物抑菌作用均较强，质量浓度为5 mg/mL时，黄柏超声波提取法和浸泡提取法获得的粗提物对菌丝生长抑制率都为100%、孢子囊萌发抑制率为61.77%和41.76%，黄柏超声波提取法和浸泡提取法粗提物抑菌丝生长的有效中浓度（EC50）分别为585.62、685.65 μg/mL。表明不同提取方法获得的粗提物抑菌活性不同，超声波提取法有利于抑荔枝霜疫霉活性物质的提取，黄柏粗提物抑荔枝霜疫霉菌活性较高。

植物粗提物；荔枝霜疫霉；超声波提取法；黄柏

曾令达，黄颖，曾海泉，等. 不同提取方法对植物粗提物抑制荔枝霜疫霉效果的影响［J］.广东农业科学，2016，43（8）：103-107.

荔枝霜疫霉（Peronophythora litchi）是荔枝霜疫霉病的病原菌［1］，荔枝霜疫霉病是目前最为严重的荔枝病害之一［2］。荔枝霜疫霉不仅为害近成熟的果实，也能为害花序、结果小枝、幼果和果柄等［3］。荔枝霜疫霉抑制和杀灭的研究，对防治荔枝霜疫霉病害和促进荔枝生产具有重要意义。荔农防治霜疫霉病的药品大多数采用具有针对性的农药，如瑞毒霉系列，特别是瑞毒霉（雷多米尔）一般为首选用药，但长时间过于集中或局限于使用某一类药，使病虫的抗药性不断增大［2］。为了提高人类的生存环境质量和食品质量，减少化学农药使用量，人们开始转向植物源农药的研究。植物源农药是国内外新农药研发的热点之一［4］。自然界拥有丰富的荔枝霜疫霉生防资源，我国对70多个科近300多种植物开展了对荔枝霜疫霉生物敏感性测试，大部分试验利用溶剂法提取有效成分和离体活性测试［5］。植物抑菌杀菌成分复杂，作为生物活性化合物的次生代谢产物超过40万种［6］。浸泡提取法和超生波提取法是目前提取植物源抑菌杀菌物质的主要方法［7］。浸泡提取法适合大多数活性物质的提取，且比较简单易行。超生波提取法具有省时、节能、提取效率高等优点，是一种快速、高效的提取新方法，并且提取中无加热过程，因此可避免加热因素引起的药物成分结构发生变化，可用于热敏性成分的提取［8］。为了解浸泡提取法和超声波提取法提取的植物粗提物对荔枝霜疫霉的抑制作用差异，本试验选用8种植物进行植物活性物质提取，比较不同植物和不同提取方法与抑菌活性的关系，并进一步将抑菌效果较好的植物做抑菌有效中浓度（EC50）测定，以期为植物抑菌作用的研究与应用提供理论依据，并为开发天然水果保鲜剂和新型植物源杀菌剂提供参考。

1　材料与方法

1.1试验材料

供试植物材料共6科8种植物（表1）。花叶良姜采自惠州学院校园，姜、百部、黄柏购于惠州市惠城区百姓缘药店，火炭母、山苍、苦参购于惠城区南门市场。荔枝霜疫霉由惠州学院生命科学系植物生理实验室提供。

表1　供试植物名录

1.2制备植物粗提物

将所采集的鲜活植物阴凉处风干后，与其他材料共置于60℃干燥箱中烘干，用粉碎机粉碎后过0.425 mm筛，备用。

1.2.1浸泡提法制备植物粗提物 分别称取60 g植物干粉于广口瓶内，倒入适量（以浸没材料为准）的95%乙醇，在室温下浸泡2次，期间摇动数次，每次浸泡24 h。每次浸泡后，用真空抽滤泵抽滤得过滤液，混合两次过滤液，乙醇定容至120 mL（提取液浓度是0.5 g/mL），4℃保存备用。

1.2.2超声波提取法制备植物粗提物 分别称取60 g植物干粉于广口瓶内，倒入适量 （以浸没材料为准）的95%乙醇，在室温下浸泡5 h，期间摇动数次，将混合物于40℃下200 W、40 kHz超声波（中国三源）提取1 h，过滤，乙醇定容至120 mL（提取液浓度是0.5 g/mL），4℃保存备用。

1.3抑菌活性测定

1.3.1抑菌丝生长测定 菌丝生长速率法参照曾令达等［9］的方法，将粗提物配成一定浓度的带药培养基，把菌饼接入培养基4 h后倒置培养5 d，用十字交叉法测量并记录菌落直径。抑菌率（%）=100（对照净生长量-处理净生长量）/对照净生长量，其中净生长量=菌落直径-菌饼直径。将抑菌百分率换算成几率值，质量浓度以对数值表示，以各粗提物不同质量浓度的对数值（X）减去菌落生长抑制率的几率值（Y），求取毒力回归方程 Y =a+bX，并计算抑制菌丝生长的EC50值。

1.3.2抑孢子囊萌发测定 孢子囊萌发法参照曾令达等［9］的方法，吸取50 μL药液与5 mL悬浮液于28℃恒温震荡培养箱中培养5 h开始镜检，以孢子芽管长度超过孢子直径50%视为已萌发孢子，计算孢子萌发抑制率。

2　结果与分析

2.1不同粗取物对荔枝霜疫霉菌丝生长的抑制作用

从表2可以看出，8种植物粗提物对霜疫霉菌菌丝生长的抑制作用，除黄柏在两种提取方法中获得的粗提物其抑菌率均为100%外，超声波提取法在姜、花叶良姜、阴香和百部等4种植物的抑菌率高于浸泡法，占57.14%。苦参、火炭母和山苍子等3种植物浸泡法提取法的抑菌率高于超声波提取法，占42.86%。从抑菌率看，超声波提取法优于浸泡提取法。苦参超声波法粗提物和苦参浸泡法粗提物对荔枝霜疫霉病菌菌丝抑制率分别为76.88%、80.64%，两种提取方法获得的粗提物抑菌活性较高。阴香、百部浸泡提取的粗提物抑菌率为负值，分别为-9.41%和-9.77%。山苍子浸泡法和超声波法提取的粗提物抑菌率均为负值，分别为-17.94%和-19.04%。抑菌率为负值说明阴香、百部和山苍子粗提物具有促进霜疫霉病菌菌丝生长的物质。

表2　不同粗提物对霜疫霉菌菌丝生长的抑制作用

2.2不同粗取物对荔枝霜疫霉孢子囊萌发的抑制作用

从表3可以看出，8种植物粗提物对荔枝霜疫霉孢子囊萌发的抑制作用中，黄柏、苦参、姜、阴香、百部和山苍子等6种植物超声波法粗提物抑菌率高于浸泡法，占总材料中的75%，仅花叶良姜和火炭母2种植物浸泡法粗提物抑菌率比超声波法高。黄柏和苦参的超声波粗提物对荔枝霜疫霉菌孢子囊萌发抑制率大于50%，分别为61.77%、51.39%。黄柏、苦参、姜、花叶良姜、火炭母和山苍子植物的浸泡粗提物，以及姜和阴香超声波粗提物对荔枝霜疫霉菌孢子囊萌发抑制率低于50%。阴香和百部的浸泡法粗提物，花叶良姜、火炭母和百部植物的超声波法粗提物对荔枝孢子囊萌发为负值，起促进作用。8种植物萌发抑制率大小不一，萌发抑制率的大小跟植物的抑菌活性和粗提物的测试浓度有关，阴香等5种植物萌发率起促进作用可能跟粗提物中含有促进孢子萌发的物质有关。

2.3不同浓度黄柏粗提物对霜疫霉菌丝生长的抑制作用

对不同提取方法获得的粗提物进行浓度梯度测试，随着浓度的提高，两种方法获得的粗提物抑菌活性增强。黄柏超声波粗提物的毒力回归方程为Y = -1.8043+2.4586X，EC50= 585.62 μg/mL；黄柏浸泡粗提物的毒力回归方程为Y = -0.9748+2.1067X，EC50= 685.65 μg/mL（表4）。

3　结论与讨论

植物活性物质的提取方法很多［10］，提取方法不同，获得的植物源抑菌杀菌物质的种类和含量不同，其药效也就不同［11-12］。本试验结果表明，不同提取方法获得的粗提物对荔枝霜疫霉的抑菌活性不同，粗提物对菌丝生长和孢子囊萌发抑制作用中，超声波提取法优于浸泡提取法。超声波提取法获得的粗提物，除黄柏菌丝生长抑菌率都达到100%外，其余7种植物中有4种植物对菌丝生长抑菌效果较好，占57.14%；对孢子囊萌发抑制中，有5种植物抑制效果较好，占75.00%。程敏等［13］以食品常见致病菌为供试菌，探讨南五味子3种不同提取方法所得乙醇提取物对致病菌的抑制作用，发现超声波提取法所得乙醇提取物对3 种致病菌的抑制作用最强。不同提取方法对黄连中小檗碱含量的影响和相应提取物的抑菌性能研究中，以超声波提取效果最佳［14］。植物抑菌物质复杂，有些侵提法的抑菌率比超声波法高，但相对于侵提法，超声波法能通过增大介质分子的运动速度以增大质的穿透力以提取中药的有效成分的方法［12］，可能是在8种植物材料中超声波法较优的原因。本试验中，黄柏菌丝生长抑菌率两种方法都达100%，说明黄拍粗提物中含有较高的抑菌活性物质，而在孢子囊萌发抑制中，超声波提取的粗提物中孢子囊萌发抑制率是61.77%；黄柏浸提物为41.76%，正好说明超声波提取法有利于黄拍的抑菌物质的提取。因此，在相同溶剂提取中，超声波提取法有利于抑菌物质的提取，在植物源抑菌剂研究中，可作为植物粗提物抑菌活性大小筛选中的一种提取方法。

表3　不同粗提物对荔枝霜疫霉菌孢子囊萌发的抑制作用

表4　不同浓度黄柏粗提物对霜疫霉菌丝生长的抑制作用

本试验的8种植物粗提物中，在5 mg/mL条件下，黄柏粗提物抑制荔枝霜疫霉菌丝生长的效果最佳，达到100%，具有较强的抑菌作用。吕君一等［15］研究发现黄柏以乙醇为溶剂的超声波提取物对西瓜枯萎病菌具有明显的抑制作用，该结果与本试验类似。曾勇等［16］用苦参的甲醇提取物中药10 mg/mL浓度处理荔枝霜疫霉病菌其菌丝生长抑制率为89.10%，认为苦参抑菌活性较强。本试验中浸泡法和超声波法两种方法提取的苦参粗提物中5 mg/mL条件下抑菌率分为80.64%和76.88%，两者试验结果较为一致。本试验植物中花叶良姜、姜和火炭母粗提物对荔枝霜疫霉菌的抑菌效果并不理想，而阴香、百部和山苍子对菌丝生长能起促进作用，说明不同的植物其抑菌效果不同，甚至有些反而具有促进病菌生长的效果。这可能与其抑菌活性物质对菌种的效应不同，或是粗提物中存在促进供试菌菌丝生长的物质有关。

黄柏具有抗菌作用，常用于抑菌研究。都日娜等［17］研究发现黄柏具有抗炎、抗菌等作用，有良好的开发前景，在果蔬保鲜上也是使用较多的抑菌植物［18］。为进一步了解黄拍的抑菌活性，本试验测定了黄柏的抑荔枝霜疫霉菌丝生长的EC50，发现黄柏超声波粗提物和浸泡粗提物的抑菌EC50分别585.62、685.65μg/mL。在植物提取物对荔枝霜疫霉的抑制研究中，吴光旭［19］发现开口箭甲醇提取物及其乙酸乙酯分部萃取物和正丁醇分部萃取物抑制荔枝霜疫霉菌菌丝生长的EC50分别为1 598.10、662.86、1 147.31 μg/mL，用甲醇提取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物溶液处理，荔枝果实接种感病率明显降低，并且上述提（萃）取物具有防治荔枝贮藏病害发生和延缓主要品质性状劣变的作用。甘草甲醇提取物的抑荔枝霜疫霉的EC50为0.62 mg/mL［20］。黄柏超声波粗提物的EC50较开口箭乙酸乙酯分部萃取物和甘草甲醇提取物的EC50小。本试验结果表明，黄柏粗提物对荔枝霜疫霉的抑菌活性强，可以作为进一步研究材料。

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（责任编辑 杨贤智）

Effects of extraction method on amtifugal activity of plant extract to Peronophythora litchi

ZENG Ling-da1，2，HUANG Ying1，ZENG Hai-quan3，YIN Yan1，2，SONG Guang-hua1，2
（1.Department of Life Science，Huizhou University，Huizhou 516007，China；2. Institute of Biotechnology， Huizhou University，Huizhou 516007，China；3.Huizhou Agricultural Science Research Institute，Huizhou 516023，China）

Eight kinds of plant extracts were obtained by ultrasonic extraction and organic solvent soaking method，and their inhibitory effects on mycelial growth and sporangial germination of Peronophythora litchi were tested. Results showed that the effect by ultrasonic extraction was better than that by soaking extraction. The extracts from Cortex phellodendri either by ultrasonic or by soaking extraction had the strongest anti-fungal activities among the 8 extracts. At the concentration of 5 mg/mL，the inhibition rate of extracts from C. phellodendri with ultrasonic extraction on mycelial growth was 100%，and on the sporangium germination was 61.77%；that of the extracts from C. phellodendri with saoking extraction on mycelial growth was also 100%，and on the sporangium germination was 41.76%. The EC50values of extracts from C. phellodendri with ultrasonic extraction and soaking extraction on inhibiting mycelial growth of P. litchi were 585.62 μg/mL and 685.65 μg/mL，respectively. Ultrasonic extraction method was suitable for extracting plant-sourced anti-fungal substances，the extracts from C. phellodendri had high inhibitor activities on P. litchi.

plant extract；Peronophythora litchi Chen；ultrasonic extraction；Cortex phellodendri

S482.2+92

A

1004-874X（2016）08-0103-05

2016-05-13

广东省科技计划项目（2013B020304010）；惠州市科技计划项目（2009B010001024）；惠州学院自然科学项目（C2110220）

曾令达（1974-），男，硕士，副教授，E-mail：hzlingda@139.com