荣骨定痛膏对骨性关节炎大鼠IL-1β、NO及氧自由基代谢的影响*

陈小平，王志旺，刘彩民△，妥海燕，王瑞琼靖远县中医院，甘肃 靖远 730600；甘肃中医药大学

荣骨定痛膏对骨性关节炎大鼠IL-1β、NO及氧自由基代谢的影响*

陈小平1，王志旺2，刘彩民1△，妥海燕2，王瑞琼2
1靖远县中医院，甘肃 靖远 730600；2甘肃中医药大学

目的：探讨荣骨定痛膏对骨性关节炎模型大鼠白介素1β（IL-1β）、一氧化氮（NO）及氧自由基代谢的影响。方法：采用注射4%木瓜蛋白酶复制骨性关节炎大鼠模型，通过观测膝关节功能，血清IL-1β、关节液NO与NOS、关节组织氧自由基代谢等指标，探讨荣骨定痛膏对骨性关节炎的治疗作用及作用机制。结果：荣骨定痛膏可明显减小骨性关节炎大鼠关节滑膜肿胀厚度，扩大膝关节的活动范围，降低血清IL-1β、关节液NO 及NOS的水平，提高滑膜组织中SOD的活性而降低MDA的含量。结论：荣骨定痛膏对骨性关节炎模型大鼠具有一定治疗作用，抑制IL-1β诱导的NO的产生而发挥抗氧化、抑制滑膜细胞的凋亡是其治疗骨性关节炎的作用机制之一。

骨性关节炎；白介素1β；一氧化氮；抗氧化系统；荣骨定痛膏

骨性关节炎是一种慢性进行性骨关节功能与结构退行性疾病，属临床常见病，目前尚缺乏有效根治措施，作为非手术疗法的中医药在治疗慢性退行性疾病过程中显示出独特的疗效而日益受到重视［1-2］。骨性关节炎属中医“痹证”范畴，多因肾气亏虚、关节失养，复受风寒湿邪，气血痹阻，经络不畅而发，治疗应补益肝肾、活血通络、祛风散寒、胜湿止痛。基于上述中医药理论形成的荣骨定痛膏在临床上取得了较好疗效。本研究通过复制骨性关节炎大鼠模型，考察荣骨定痛膏对骨性关节炎大鼠膝关节结构与功能、IL-1β、NO及氧自由基代谢的影响，探讨荣骨定痛膏防治骨性关节炎的作用及机制，为临床用药提供理论依据，现将结果报道如下：

1　材料与方法

1.1药物荣骨定痛膏(每毫升软膏剂含原生药1.5 g，靖远县中医院提供，批号：20140610)；盐酸氨基葡萄糖胶囊(浙江诚意药业有限公司生产，批号：20130603)。

1.2试剂木瓜蛋白酶(美国Sigma公司生产，批号：118K1461)；IL-1β试剂盒(北京华英生物技术研究所提供，批号：20140608)；NO、NOS、SOD、MDA与考马斯亮蓝蛋白试剂盒(南京建成生物工程研究所提供，批号：20140520、20140520、20140501、20140512与20140601)。其余试剂为分析纯。

1.3动物SPF级SD雄性大鼠，体质量180～220g，由甘肃中医学院实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK(甘)2004-0006，SPF级实验室许可证号：SYXK(甘)2011-0001。

1.4仪器Cole-Parmer LabGEN125匀浆机(北京中科科尔仪器有限公司)；TGL-16G高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂生产)；N-5600PC型METASH可见分光光度计(上海元析仪器有限公司生产)；HH-S型恒温水浴锅(金坛市正基仪器有限公司生产)；BS1103 sar torius电子天平(北京赛多里斯有限公司)。

1.5方法

1.5.1分组、造模及给药取SD雄性大鼠48只，按体质量随机分为6组，即正常对照组，模型对照组，氨基葡萄糖组(90mg/kg)，荣骨定痛膏高、中、低剂量组(120、60、30mg/d)各8只。各组大鼠膝关节及周围皮肤脱毛，参照相关实验方法［3-4］，在造模的第1、3、7天，将4%木瓜蛋白酶生理盐水溶液50μL注入大鼠膝关节腔内，正常对照组注射等量生理盐水。造模的同时给药，即在大鼠膝关节涂抹不同浓度(1.500、0.750、0.375 g/mL)荣骨定痛膏40μL，氨基葡萄糖组灌胃0.9%氨基葡萄糖5mL/kg，正常对照组与模型对照组膝关节涂抹蒸馏水，2次/d，连续5周。

1.5.2取材、检测指标末次涂药2小时后，用水合氯醛麻醉大鼠，在室温下由同一人测量被动膝关节活动度，即于膝关节等距离处垂直施以相等的力量伸展后回缩大鼠左、右膝关节，用量角器测量其伸展至回缩的角度并计算平均值［5］。股静脉采血，待血液自然凝固2小时后，分离血清，按试剂盒说明书测定血清IL-1β的水平。取血后，向大鼠膝关节内注射生理盐水，0.1mL/次，反复抽吸后，抽取关节灌洗液，每个关节抽洗3次，将关节灌洗液2 000 r/min离心10分钟，取上清液测定NO、NOS的水平。处死大鼠，切取完整膝关节，立即打开关节腔，刮取关节面上的滑膜组织，用螺旋测微器于固定位置测定关节滑膜厚度［5］，之后立即置冰浴中的组织匀浆器内，加入冰生理盐水，制成2%滑膜组织匀浆，在4℃下4 000 r/min离心10分钟，取上清液，按试剂盒说明书测定SOD的活性及MDA的含量。

1.6统计学方法数据应用SPSS 11.5统计软件分析，计量资料以±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1荣骨定痛膏对骨性关节炎大鼠膝关节活动范围、关节滑膜厚度的影响大鼠膝关节注射木瓜蛋白酶35天后膝关节活动范围缩窄，关节滑膜肿胀厚度增加，与正常对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。经荣骨定痛膏治疗后，膝关节的活动范围扩大，关节滑膜肿胀厚度减小，与模型对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；与荣骨定痛膏低剂量组比较，荣骨定痛膏高剂量组的治疗作用更强(P＜0.05)，见表1。

表1　荣骨定痛膏对骨性关节炎大鼠膝关节活动范围、关节滑膜厚度的影响χ±s）

表1　荣骨定痛膏对骨性关节炎大鼠膝关节活动范围、关节滑膜厚度的影响χ±s）

注：与正常对照组比较，※※表示P＜0.01；与模型对照组比较，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01；与荣骨定痛膏低剂量组比较，▲表示P＜0.05。

组别　只数　剂量　关节活动范围/°　关节滑膜厚度/mm正常对照组　8　-　158.86±7.79　0.25±0.04模型对照组　8　-　103.19±12.58※※　0.39±0.07※※氨基葡萄糖组　8　90mg/kg　127.25±13.13△△　0.28±0.05△△荣骨定痛膏高剂量组　8　120mg/d　133.03±14.12△△▲　0.30±0.05△▲荣骨定痛膏中剂量组　8　60mg/d　121.69±13.00△　0.32±0.06△荣骨定痛膏低剂量组　8　30mg/d　117.34±12.93△　0.36±0.06

2.2荣骨定痛膏对骨性关节炎大鼠IL-1β、NO及NOS的影响复制骨性关节炎模型大鼠35天，血清IL-1β水平与关节灌洗液NO与NOS的水平升高，与正常对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)；经荣骨定痛膏治疗后，IL-1β、NO与NOS的水平有所下降，其中荣骨定痛膏高剂量组及中剂量组与模型对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

2.3荣骨定痛膏对骨性关节炎大鼠关节组织中抗氧化酶及氧化产物的影响骨性关节炎模型大鼠关节滑膜组织中SOD的活性降低，MDA的含量增加，与正常对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。荣骨定痛膏治疗35天后，滑膜组织中SOD的活性显著升高，MDA的含量下降，与模型对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；与荣骨定痛膏低剂量组比较，高、中剂量组的作用更强(P＜0.01)，见表3。

表2　荣骨定痛膏对骨性关节炎大鼠IL-1β、NO及NOS的影响χ±s）

表2　荣骨定痛膏对骨性关节炎大鼠IL-1β、NO及NOS的影响χ±s）

注：与正常对照组比较，※※表示P＜0.01；与模型对照组比较，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01。

组别　只数　剂量　IL-1β/（μg·L-1）　NO/（μmol·L-1）　NOS/（U·mL-1）正常对照组　8　-　0.093±0.015　6.16±1.34　2.33±0.41模型对照组　8　-　0.269±0.036※※　9.87±2.08※※　3.85±0.74※※氨基葡萄糖组　8　90mg/kg　0.241±0.035　7.98±1.70　3.41±0.69荣骨定痛膏高剂量组　8　120mg/d　0.208±0.033△△　7.18±1.51△　2.83±0.60△△荣骨定痛膏中剂量组　8　60mg/d　0.225±0.034△　7.72±1.70△　3.08±0.61△荣骨定痛膏低剂量组　8　30mg/d　0.231±0.035　8.36±1.73　3.45±0.68

表3　荣骨定痛膏对骨性关节炎大鼠关节组织中抗氧化酶及氧化产物的影响χ±s）

表3　荣骨定痛膏对骨性关节炎大鼠关节组织中抗氧化酶及氧化产物的影响χ±s）

注：与正常对照组比较，※※表示P＜0.01；与模型对照组比较，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01；与荣骨定痛膏低剂量组比较，▲▲表示P＜0.01。

组别　只数　剂量　SOD/（U·mg-1）　MDA/（nmoL·mg-1）正常对照组　8　-　96.22±10.35　20.95±4.08模型对照组　8　-　64.87±7.97※※　102.58±16.75※※氨基葡萄糖组　8　90mg/kg　75.36±8.15△　83.70±14.93△荣骨定痛膏高剂量组　8　120mg/d　122.76±15.48△△▲▲　34.44±9.31△△▲▲荣骨定痛膏中剂量组　8　60mg/d　107.41±12.77△△▲▲　51.49±11.44△△▲▲荣骨定痛膏低剂量组　8　30mg/d　79.80±8.36△△　81.00±14.85△

3　讨论

骨性关节炎(osteoar thritis，OA)也称骨关节病、退行性关节炎等，好发于膝关节、髋关节、脊柱及手指等部位，是一种多发于老年人的慢性进行性骨关节疾病。随着社会进入老龄化，该病发病率逐年增加。据统计，美、英等西欧国家有5%～10%的成年人患有骨性关节炎，此病与心血管疾病、创伤并列前3位，每年需手术治疗者达几十万人，由此产生的社会经济负担对社会经济发展有较大影响［6］。随着我国社会人口结构的迅速老龄化，本病不但是公共卫生问题，而且也成为社会问题，日益引起人们的重视，因此，防治OA已成为各国骨科学界的重要课题。OA的发病机制复杂，但其基本病理变化为关节软骨的退行性变与关节的增生性改变(特别是软骨周围及滑膜处)。目前临床尚缺乏有效的根治措施，治疗目的为缓解关节疼痛，改善关节功能并促进重建受损的软骨及骨结构；由于手术治疗缺乏确切有效的临床治疗方案，使得病程明显延长，作为非手术疗法的中医药日益受到人们的重视［7］。

中医理论认为，OA多因肾气亏虚，关节失养，局部劳损闭阻；复感风寒湿邪，经络不畅，气血痹阻，关节寒凝、痰阻，不通则痛，故治疗应补益肝肾、活血通络、祛风散寒、胜湿止痛［8-9］。在此基础上拟定的荣骨定痛膏由山茱萸、杜仲、牛膝、当归、秦艽、独活、川乌等40余味中药组成，临床应用效果良好。本动物实验结果显示，荣骨定痛膏可明显扩大病变关节的活动范围，减小滑膜肿胀厚度，改善骨性关节炎关节的结构与功能。

IL-1是最早也是最重要的骨性关节炎促炎因子，成熟的IL-1β是由IL-1转换酶裂解IL-1β前体而来［10］。在正常关节中IL-1含量极少且主要是IL-1β，在骨性关节炎中，IL-1特别是IL-1β的含量异常升高。骨性关节炎中IL-1影响软骨细胞的结构和功能，促进其凋亡，打破软骨基质合成与代谢间的平衡，使滑膜炎性病变，最终导致关节软骨的破坏。在关节软骨中，软骨细胞对于保持关节软骨功能和结构发挥着重要作用，IL-1参与关节软骨破坏的起始和进展：一方面，IL-1杀伤线粒体呼吸链，导致线粒体功能紊乱，软骨细胞的能量供应减少，使软骨细胞活性下降［11］；另一方面，IL-1激活并提高诱导型一氧化氮合酶的活性，使NO合成增加［12］，而一氧化氮可促进软骨细胞的分解代谢，加速软骨细胞的凋亡［13］。同时，一氧化氮属于活性氮自由基，可引起活性氧的产生而加速脂质过氧化反应，对DNA、内质网及胶原合成酶造成损伤，导致软骨细胞功能紊乱［14］。骨性关节炎时滑膜常出现异常病变，IL-1通过影响NO控制线粒体功能，影响细胞周期蛋白而损害骨性关节炎中的滑膜细胞［15］。本实验证实荣骨定痛膏在治疗骨性关节炎的过程中可降低IL-1β、NO及NOS水平，提高滑膜组织中SOD的活性而降低MDA的含量。

综上所述，荣骨定痛膏对骨性关节炎有一定治疗作用，缓解IL-1、NO及氧自由基代谢的异常变化是其作用机制之一。

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The In fluence of RongGu DingTong Ointm ents on IL-1β，NO and Oxygen Free RadicalMetabolism ofOA Rats

CHEN Xiaoping1，WANG Zhiwang2，LIU Caimin1△，TUO Haiyan2，WANG Ruiqiong2
1 Jingyuan County TCM Hospital，Jingyuan 730600，China；2 Gansu University of Traditional Chinese Medicine

Objective：To discuss the effectsof RongGu DingTong ointmenton IL-1β，NO and oxygen free radicalmetabolism of the ratsw ith osteoarthritis（OA）.Methods：OA ratmodelwasestablished by injecting 4%papain，therapeutic effects and itsmechanism of RongGu DingTong ointmentwere studied by observing knee joint function，the contentsof IL-1β，NO and NOS，and oxygen free radicalmetabolism in joint tissue.Results：RongGu DingTong ointmentcould reduce the thicknessof jointsynovialswelling of OA rats，increase the range ofmotion of knee joint，decrease the levels of IL-1β，NO and NOS，and improving SOD activity in synovial tissue therefore to decrease the contents of MDA.Conclusion：RongGu DingTong ointment is effective in treating OA rats to a certain degrees，one of itsmechanisms is inhibiting NO generation induced by IL-1β，hence to develop antioxidant functions and inhibit theapoptosisof synovialcells.

osteoarthritis；IL-1β；NO；antioxidantsystem；RongGu DingTong ointment

R684.3

A

1004-6852（2016）07-0023-04

2015-06-25

甘肃省中医药管理局科研课题基金项目（编号GZK-2013-38）。

陈小平（1971—），男，副主任医师。研究方向：风湿病、骨病的中医药研究与治疗。

刘彩民（1956—），男，副主任医师。研究方向：风湿病、骨病的中医药研究与治疗。