清肝祛湿活血方对非酒精性脂肪肝大鼠Srebp-1c表达的影响*

张玉香，王一强，姜德民，史晓伟，王俊喹甘肃省中医学校，甘肃 兰州 70050；2甘肃省中医院；西和县中医医院

清肝祛湿活血方对非酒精性脂肪肝大鼠Srebp-1c表达的影响*

张玉香1，王一强1，姜德民1，史晓伟2△，王俊喹3
1甘肃省中医学校，甘肃 兰州 730050；2甘肃省中医院；3西和县中医医院

目的：探讨清肝祛湿活血方对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏固醇调节元件结合蛋白-1c（Srebp-1c）表达的影响。方法：将雄性SD大鼠随机分为空白组，模型组，多烯磷脂酰胆碱组，清肝祛湿活血方低、中、高剂量组6组。常规饲养7天后，空白组给予普通饲料喂养；其余各组给予高脂饲料喂养+腹腔注射四环素制备非酒精性脂肪肝大鼠模型，共4周。造模成功后清肝祛湿活血方各剂量组用清肝祛湿活血方治疗，多烯磷脂酰胆碱组予易善复治疗，模型组和空白组给予等量蒸馏水。给药4周后观察大鼠血脂、肝组织病理学改变及Western Blot法测定肝脏Srebp-1c表达。结果：与模型组比较，清肝祛湿活血方低、中、高剂量组TG和TC明显降低（P＜0.05）；肝脂肪变性明显减轻；肝脏Srebp-1c表达均明显下降（P＜0.01）。结论：清肝祛湿活血方能下调大鼠肝脏Srebp-1c表达，对非酒精性脂肪肝有较好的治疗作用。

非酒精性脂肪肝；清肝；祛湿；活血；Srebp-1c

非酒精性脂肪肝(non alcohol ic fatty l iver disease，NAFLD)是以肝实质细胞脂肪变性和脂肪堆积为主要病理特征，但无过量饮酒史的一种肝病综合征［1］。目前已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病［2］，被公认为隐蔽性肝硬化的常见原因。研究表明［3-4］固醇调节元件结合蛋白-1c (Srebp-1c)主要参与调节肝脏中脂肪酸和甘油三酯的合成，并参与非酒精性脂肪肝的发生发展［5］。但是目前尚缺少减少脂肪堆积的药物，前期临床观察发现当地名医王俊喹自拟清肝祛湿活血方对ANFLD有较好的治疗作用，但作用机制不明确。本研究采用清肝祛湿活血方干预高脂饮食诱发NAFLD大鼠模型，观察大鼠肝脏组织SREBP-1c表达、血脂及病理改变，探讨清肝祛湿活血方对NAFLD保护机制。

1　材料与方法

1.1动物选取同批雄性SD大鼠90只，清洁级，体质量(150±20)g，购自甘肃中医药大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXKG桂2009-0002。实验前将动物置于室内适应环境1周，室温18～20℃，标准大鼠饲料喂养，自由进食，饮用自来水。1.2药物清肝祛湿活血方中药煎剂(夏枯草10 g，密蒙花10g，青葙子10 g，茵陈10 g，垂盆草10 g，丹参15 g，郁金10 g)由甘肃中医药大学药学实验室制备。多烯磷脂酰胆碱(易善复，北京安万特制药有限公司生产，国药准字J20050028，规格228mg/粒)。

1.3试剂大鼠固醇调节元件结合蛋白1C (Srebp-1c，批号：201508）、总胆固醇(TC，批号：201509)、甘油三酯(TG，批号：201509)检测试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司。

1.4仪器TOSHIBATBA－120FR全自动生化分析仪(日本东芝公司)；OHAUS1/1000型电子天平(美国BECKANCOULTER公司)；IX71-22FL/PH倒置荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)；HH-S型数显恒温水浴箱(江苏省金坛市医疗仪器厂)；LKB-Ⅲ型超薄切片机切片(瑞典LKB公司)；5417R低温高速离心机(德国EPPENDORF公司)；TC-120智能程控生物组织自动脱水机 (湖北省孝感市泰维电子设备有限公司生产)。

1.5方法

1.5.1实验分组与造模将90只SD大鼠按照随机数字表法分为6组：空白组，模型组，多烯磷脂酰胆碱组，清肝祛湿活血方低、中、高剂量组，(以下分别简称：空白组，模型组，易善复组，低剂量组，中剂量组，高剂量组)，每组15只。常规饲养7天后，空白组给予普通饲料喂养60天；其余各组按照聂文山等［5］的造模方法，予高脂饲料(84%基础饲料+10%猪油+5%蛋黄粉+1%胆固醇)，并于制模后腹腔注射四环素150mg/kg，以后每6天腹腔注射1次四环素100mg/kg，共计6次，并于实验前(0d）和制模后第6、12、18、24、30天测量大鼠体质量，并根据体质量调整给药量，第30天造模成功(已经通过预实验，病理切片显示此造模方法成功)。

1.5.2给药方法造模结束后，即第31天开始，参照《药理实验方法学》中［6］人与大鼠剂量的换算方法计算出大鼠用药量是成人剂量的9倍。算出大鼠的对应给药量。即清肝祛湿活血方低剂量组给予5.63g生药/kg、中剂量组给予11.25 g生药/kg、高剂量组给予22.5 g生药/kg，易善复组参照文献［7］给予550mg/(kg·d)。使用时，按照大鼠灌药容积20mL/kg计算，用蒸馏水将清肝祛湿活血方煎剂配成小剂量组0.28 g/mL、中剂量组0.56 g/mL、大剂量组1.13 g/mL，造模成功后大鼠平均体质量按200 g/只计算，各组大鼠每次每只灌胃4mL，1次/d。空白组与模型组给予蒸馏水代替，灌胃量4mL/d，1次/d。各组连续给药30天。实验过程中观察比较各组大鼠的一般情况。

1.6指标采集与检测

1.6.1大鼠固醇调节元件结合蛋白1c（Srebp-1c）检测取100mg肝脏组织，提取肝脏组织总蛋白，每个样品取等量蛋白50μg，将12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后分离的蛋白质转移到PVDF膜。5%BSA室温下封闭2小时，加入小鼠抗大鼠SPEBP-1c(稀释比例1∶500）、小鼠抗大鼠β-actin(稀释比例∶1000)一抗，4℃孵育过夜。洗膜后辣根过氧化物酶标记的二抗羊抗兔IgG或羊抗小鼠IgG(稀释比例1∶5000)，室温孵育2小时。TBST洗膜后加ECT试剂，显影成像。用美国UVP公司Lab Works 4.5软件对Western blot条带进行定量分析。

1.6.2血清生化指标的检测沿大鼠腹中线迅速剪开腹腔，用10mL注射器无菌采取腹主动脉血8mL，常规分离血清，-20℃冻存备测，用于测定TC、TG。

1.6.3肝脏组织学观察各组大鼠15只，留取肝左叶同一部位新鲜肝组织，清洗后置于10%中性甲醛固定，HE染色，送病理检查作组织切片。病理改变评分参考文献［8］：脂肪变性评分：0(无)，1(肝细胞含脂滴小于25%)，2(肝细胞含脂滴26%～50%)，3(肝细胞含脂滴51%～75%)，4(肝细胞含脂滴大于75%)。根据汇管区、肝叶内炎症细胞浸润程度评分炎症：0(无)，1(轻微)，2(轻度)，3(中度)，4(重度)。坏死评分：0(无)，1(轻微)，2(轻度)，3(中度)，4(重度)。

1.7统计学方法数据采用SPSS 13.0统计软件包进行处理，计量资料以(χ±s)表示，采用单因素方差分析和Newman-Keuls检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

各组大鼠进食、进水良好，精神度好，清肝祛湿活血方各组灌胃反应较强烈，经解剖观察食管破裂及肺部感染导致8只死亡(其中低剂量组和中剂量组各2只，高剂量组4只)；易善复组1只死亡，经解剖发现为尿路梗阻。最终81只大鼠采集到实验数据。

2.1各组大鼠肝脏组织病理形态变化与评分变化空白组肝小叶结构完整，肝细胞索清楚，细胞核位于细胞中央,胞质丰富，肝窦排列规则，汇管区清晰，见图1A。模型组肝小叶结构明显紊乱，肝细胞索消失，肝窦消失，出现弥漫性肝细胞空泡样变性,肝细胞变大，胞质内充满脂滴，小叶内见局灶性肝细胞坏死，有明显炎症细胞浸润，见图1B。易善复组、低剂量组和中剂量组脂变程度较模型组减轻，空泡样变肝细胞较模型组数目明显减少，胞浆内仅见少量脂肪滴，小叶内局灶性肝细胞坏死，少量炎症细胞浸润，见图1C、1D、1E。高剂量组脂变程度较模型组明显减轻，肝小叶结构基本完整，肝索排列清楚，空泡样变肝细胞明显消失，胞浆内脂肪滴明显减少，小叶内极少量炎症细胞浸润，见图1F。病理改变评分见表1。

图1　各组大鼠肝组织病理切片（HE×400）

表1　各组大鼠肝脏组织病理改变评分

2.2各组大鼠TG、TC及Srebp-1c变化与空白组比较，非酒精性脂肪肝大鼠TG、TC、Srebp-1c提高(P＜0.01)；与模型组比较，清肝祛湿活血方各剂量组TG、TC、Srebp-1c降低(P＜0.05)，高剂量组降低最显著(P＜0.01)，见表2。

表2　各组大鼠TG、TC和Srebp-1c变化比较

3　讨论

NAFLD主要是由于肥胖、糖尿病、高脂血症、胰岛素抵抗等临床病症累及肝脏引起病理学改变而造成［9］。其中关键影响因素之一是血浆游离脂肪酸(f ree fat ty acid，FFA)及甘油三酯(t riglyceride，TG)合成显著增加。SREBP-1c属于固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element binding proteins，SREBPs)的一个亚型，主要参与脂肪酸代谢和糖代谢，是脂肪合成基因的主要转录调节因子。高脂饮食引起sREBP-1c表达增强，最初是一种适应性反应，随着Srebp-1c表达进一步增强，导致脂肪酸代谢失衡，TG合成增多，与NAFLD的发生关系密切［9-10］。本研究显示模型组SD大鼠通过高脂饲料喂养，腹腔注射四环素后Srebp-1c、TG、TC较空白组明显升高；其肝脏病理切片可见肝小叶结构明显紊乱，肝细胞索消失，肝窦消失，出现弥漫性肝细胞空泡样变性，肝细胞变大，胞质内充满脂滴，小叶内见局灶性肝细胞坏死，有明显炎症细胞浸润。证实上述实验造模成功。

Srebp-1c主要参与糖脂代谢，其高表达导致肝脏脂代谢异常，形成“初次打击”［11］；脂肪组织炎症是NAFLD发展的因素和病理表现［12-13］，且最终导致肝纤维化的发生［14］，形成“二次打击”［11］。本研究结果表明，与模型组比较，清肝祛湿活血方各剂量组均能够明显降低NAFLD大鼠Srebp-1c、TG、TC水平，减轻脂肪组织炎症，从而减少胞质内脂肪滴沉积，减少细胞变性，达到保护肝细胞、治疗NAFLD的效果。

中医认为NAFLD属于“痰证”“浊毒”“积证”“胁痛”“肥气”等范畴。基本病机为肝热脾虚，痰湿瘀结［14-15］。其病位主要在肝，当地名医王俊喹四诊合参，并结合现代人群饮食习惯，认为NAFLD主要为肝经湿热瘀阻所致，今人工作、生活压力大导致肝气郁结，久郁化热，又兼嗜食肥甘厚腻而少动致脾虚湿盛，中焦气机失调，湿与热结，郁于肝经，经络不通化为瘀血，发为NAFLD，故治疗当清肝祛湿，活血通络，依法自拟清肝祛湿活血方。方中夏枯草清肝凉血、垂盆草清利肝胆湿热、郁金疏肝活血，共为君药；密蒙花、青葙子助夏枯草清肝凉血；茵陈助垂盆草清肝胆湿热；丹参助郁金凉血活血、且养心安神，共为臣药；干姜温中散寒、燥湿化痰，防寒凉伤胃，为佐药。诸药合用共奏清利肝胆湿热，活血化瘀散结，温中燥湿化痰之功。现代药理研究表明［16］夏枯草含有三萜类、甾醇类等成分，有降血压、降血脂、降血糖、抗氧化、抗自由基等作用，另外夏枯草还有调节内分泌的功能；垂盆草［17］具有保肝、免疫调节等作用；郁金［18］具有抗氧化、抗炎、抗血小板聚集的作用。

本研究表明清肝祛湿活血通过减少NAFLD大鼠肝脏组织Srebp-1c蛋白表达，降低TG、TC，改善血脂代谢，同时此方还能够减轻脂肪组织炎症，减少胞质内脂肪滴沉积，减少细胞变性，对NAFLD有较好的治疗作用。有研究表明［10］非酒精性脂肪肝大鼠Srebp-1c的mRNA表达变化先于肝脏组织学改变，本方是否通过减少肝脏组织Srebp-1c蛋白的表达改善肝脏组织学改变有待进一步研究。

［1］ 陈少东，李红山，冯琴，等.脂肪肝中医证型分类的文献分析［J］.中西医结合肝病杂志，2006，16（4）：255-257.

［2］ 王吉耀.脂肪肝临床流行病学［J］.中华肝脏病杂志，2000，8（2）：115-117.

［3］ Yamamoto T，Watanabe K，Inoue N，et al.Protein kinase Cbeta mediates hepatic induction of sterol-regulatoryelement binding protein-1cbyinsul in［J］.J Lipid Res，2010，51（7）：1859-1870.

［4］ Yahgi N，Shimano H，Hasty AH，et al.A crucial role of sterol regulatory element-binding protein-1 in the regulation of lipogenic gene expression by polyunsaturated fatty acids［J］.J Biol Chem，1999，274（50）：25840-35844.

［5］ 聂山文，赵文霞，石艳芬，等.高脂饲料联合四环素腹腔注射复制非酒精性脂肪肝大鼠模型的实验研究［J］.中国中西医结合急救杂志，2013，20（6）：374-375.

［6］ 徐叔云，卞如濂.药物实验方法学［M］.北京：人民卫生出版社，2005：1349.

［7］ 江庆澜，徐邦军，杨辉，等.多烯磷脂酰胆碱对非酒精性脂肪肝大鼠的干预效果［J］.广州医学院学报，2005，33（4）：4-6.

［8］ 俞泽元，赵荣荣，盖大伟，等.SREBP-1C、GRP-94在非酒精性脂肪肝中的表达及意义［J］.中国现代医学杂志，2014，24（17）：23-27.

［9］ 唐外姣.护肝清脂片治疗非酒精性脂肪肝病的药效学研究及机制探讨［D］.广州：南方医科大学，2013.

［10］艾正琳，陈东风.SIEBP-1c在大鼠非酒精性脂肪性肝病中的表达及意义［J］.第三军医大学学报，2006，28（10）：1063-1065.

［11］娜日苏，包纳日斯.非酒精性脂肪肝的发病机制与流行病学的研究进展［J］.中国医药指南，2016，14（3）：39-40.

［12］du Plessis J，van Pel t J，Kor f H，et al.Association of adipose tissue inf lammation with histologic severity of non alcoholic fat ty l iver disease［J］.Gastroenterology，2015，149（3）：635-648.

［13］Angulo P，Kleiner DE，Dam-Larsen S，et al.Liver f ibrosis，but no other histologic features，is associated with long-term outcomes of patients with nonalcohol ic fat ty liver disease［J］.Gast roenterology，2015，149（2）：389-397.

［14］张顺贞，石安华，姚政，等.非酒精性脂肪肝中医病因病机探讨［J］.云南中医中药杂志，2015，36（1）：17-19.

［15］王玉衡，张海鸥.非酒精性脂肪肝的中医药治疗进展［J］.中医药通报，2014，13（4）：64-66.

［16］崔体圣，苗明三、夏枯草的化学、药理及临床应用探讨［J］.中医研究，2014，29（13）：386-388.

［17］李慧娟，杜成林，王晓静.垂盆草的研究进展［J］.药学研究，2015，34（11）：661-663.

［18］王颖，郭兰萍，黄璐琦，等.姜黄、莪术、郁金的化学成分与药理作用研究进展［J］.中国药房，2013，24（35）：3338-3342.

The Influenceof QingGan QuShi HuoXue Prescription on the Expressions of Srebp-1c of the Ratsw ith Non Alcoholic Fatty Liver D isease

ZHANG Yuxiang1，WANG Yiqiang1，JIANG Demin1，SHIXiaowei2△，WANG Junkui3
1 Gansu Provincial TCM School，Lanzhou 730050，China；2 Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine；3 Xihe County TCM Hospital

Objective：To explore the effectsof QingGan QuShi HuoXue prescription on the expressions of liver sterol regulatory elementbinding protein-1c（Srebp-1c）of the ratsw ith non alcoholic fatty liver disease（NAFLD）. Methods：A llSD ratswere random ized into the blank group，themodelgroup，phosphatidylcholine group，low，moderate and high doses groups of QingGan QuShi HuoXue prescription.A fter given conventional feed for seven days，the blank group accepted normal feed；other groups received high fatty feed and intraperitoneal injection of tetracycline to establish themodelsof NAFLD，for fourweeks，differentdosesgroups of QingGan QuShi HuoXue prescription were treated w ith QingGan QuShi HuoXue prescription，phosphatidylcholine group w ith rehabilitation therapy，themodel group and the blank group the same amountof distilled water after successfully establishing themodels. A ftermedicating for four weeks，pathological changes of liver tissue were observed，and the expressions of liver Srebp-1c were detected by Western Blotting method after detecting the blood lipid.Results：Compared w ith the model group，the levels of TG and TC decreased obviously in low，moderate and high doses groups of QingGan QuShiHuoXue prescription（P＜0.05）；liver fatty degeneration alleviated obviously；the expressions of liver Srebp-1c lowered notably（P＜0.01）.Conclusion：QingGan QuShi HuoXue prescription could down regulate the expressionsof liver Srebp-1c of the rats，which showsbettereffects in treating NAFLD.

non alcoholic fatty liverdisease；QingGan；QuShi；HuoXue；Srebp-1c

R575.5

A

1004-6852（2016）07-0019-04

2015-06-25

甘肃省中医药管理局项目（编号GZK-2015-7）。

张玉香（1982—），女，硕士学位，讲师。研究方向：内科疾病的中医药防治。

史晓伟（1983—），男，硕士学位，主治医师。研究方向：糖尿病及其并发症的中医药防治。