参桂保心浓煎剂对心衰大鼠NT-pro BNP 及Caspase-3的影响*

马晓庆，钟　栩，党婵娟甘肃中医药大学，甘肃　兰州730000；2甘肃省第三人民医院；3甘肃中医药大学附属医院

参桂保心浓煎剂对心衰大鼠NT-pro BNP 及Caspase-3的影响*

马晓庆1，2，钟栩3△，党婵娟1
1甘肃中医药大学，甘肃兰州730000；2甘肃省第三人民医院；3甘肃中医药大学附属医院

目的：探讨参桂保心浓煎剂对异丙肾上腺素（Isoproterenol，ISO）诱导左心室功能不全大鼠血清N-端脑钠肽前体（NT-pro BNP）和心肌半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）的影响。方法：将50只雄性Wistar大鼠随机分模型组，低、中、高剂量组和空白组，每组10只。模型组予致心力衰竭剂量（85mg/kg）ISO后给予等容量的生理盐水，空白组不予任何干预，余各组ISO给药后予低、中、高剂量的参桂保心浓煎剂治疗，8周后采用ELISA法测NT-pro BNP含量，HE染色观察心肌组织形态学，免疫组化检测Caspase-3蛋白表达。结果：1）与模型组相比，各药物组均可降低NT-pro BNP水平（P＜0.01），但仍高于空白组（P＜0.01），与中剂量相比，低剂量组无明显差别（P＞0.05），高剂量组显著下降（P＜0.01）。2）与模型组相比，各药物组均能抑制Caspase-3表达（P＜0.01），但仍高于空白组（P＜0.01），其抑制作用高剂量组强于中剂量组（P＜0.01），中剂量组强于低剂量组（P＜0.05）。结论：参桂保心浓煎剂能降低ISO诱导的左心室功能不全大鼠NT-pro BNP水平，改善心功能，可能机制是抑制Caspase-3过度表达，阻断细胞凋亡。

心力衰竭；NT-pro BNP；Caspase-3；参桂保心浓煎剂

心力衰竭（简称心衰）是心脏病患者死亡的主要原因。1996年Sharov等［1］在心衰狗模型中发现了凋亡细胞，首次证实了心肌细胞凋亡与心力衰竭的关系。近10年研究认为心肌细胞凋亡是心力衰竭重要的病理生理机制之一，抑制细胞凋亡可减轻心脏重塑，改善心衰［2］。Caspase-3是凋亡途径最重要的执行性Caspase酶原，Caspase-3的激活，细胞将不可避免地发生凋亡［3］。心衰时，心肌分泌的BNP及NT-Pro BNP是国际公认的心衰血浆标志物，研究指出NT-pro BNP在心功能受损时具有更高的敏感性，是心衰早期诊断、评价疗效和预后更有优势的指标［4］。本实验通过观察参桂保心浓煎剂对早期心衰大鼠血清NT-pro BNP水平及心肌细胞Caspase-3表达的影响，评价早期应用该药对心衰的防治作用及其机制。

1　材料与方法

1.1动物与分组SPF级Wi s t a r雄性大鼠，体质量(200±20)g，8～10周龄，购自甘肃中医药大学动物实验中心，随机分为空白组，模型组，参桂保心浓煎剂低、中、高剂量组，每组10只。实验动物许可证号：SYXK(甘)2015-0005，实验动物质量合格证号：SCXK(甘)2015-0002。

1.2药物与试剂盐酸异丙肾上腺素(I SO，美国Sigma公司，上海伊卡公司分装)；水合氯醛(大连美仑生物有限公司，批号20120324)；参桂保心浓煎剂药物组成：西洋参、麦冬、五味子、桂枝、白术、茯苓、猪苓、泽泻、车前子、丹参、葶苈子、大枣，由甘肃中医药大学附属医院制剂科制备。大鼠NT-Pro BNP ELISA检测试剂盒(上海源叶生物科技有限公司)；大鼠Caspase-3检测试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)；SP即用型检测试剂盒(中杉金桥生物技术有限公司)；DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3仪器Be n c hma r k P l s连续波长酶标仪(美国BioTek公司提供)；ASP200S自动组织脱水机(德国Leica公司提供)；FINESSE 325石蜡切片机(美国Thermo公司提供)；3K15台式高速冷冻离心机(美国SIGMA公司提供)；KD-BL石蜡组织包埋机(科迪仪器设备公司提供)；RHY-3病理组织漂烘仪(中威电子仪器有限公司提供)；BH-50光学显微镜(日本OLYMPUS公司提供)；DW-86L386低温冰箱(日本SANYO有限公司提供)。

1.4给药方法空白组不予任何干预，余4组采用皮下注射ISO 85mg/kg，1次/d，共2次造模。ISO给药结束后间隔24小时低、中、高剂量组分别予参桂保心浓煎剂6.5、13、26 g/(kg·d)(根据人鼠体表面积等效量换算比率计算，每kg体质量大鼠给药剂量是6倍人每kg剂量)，每日1次灌胃；模型组予等容量生理盐水1次/d灌胃。

1.5指标检测各组大鼠在相同条件下饲养，8周后对所有存活大鼠进行血清NT-pro BNP测定，各组随机选5只进行HE染色，免疫组化染色，进行Caspase-3表达免疫组化评分。

1.5.1血清NT-P r o BNP检测1 0%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，采用摘眼球取血方法取血3mL，高速低温(3 000 rpm，4℃)离心10分钟，取血清标记，随后将标本置于-20℃冰箱保存，备检。采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定大鼠血清NT-Pro BNP的水平，严格按照说明书步骤操作。

1.5.2 HE染色采血后，立即摘除大鼠心脏并放置于4℃生理盐水中冲洗心腔内残余血液，滤纸吸干水分，沿大鼠心脏纵轴切取左心室中段心肌，浸入10%甲醛溶液固定，常规脱水，透明，浸蜡，包埋，切片，漂片，摊片，烘片，标记备用。随后切片脱蜡，水化，苏木精染色，分色，返蓝，伊红液色，冲洗，脱水，透明，封片，光学显微镜下观察心肌组织形态学。

1.5.3心肌Ca s p a s e-3表达检测切片脱蜡，水化，高压高温抗原修复，采用SABC免疫组化方法，一抗用1∶200的大鼠Caspase抗体，并以PBS代替一抗作阴性对照片，显微镜下观察，切片中以细胞胞浆呈淡黄色，棕黄色，棕褐色为阳性细胞判断标准，分别取5个高倍视野(×400)，参考许良中［5］免疫组织化学反应结果的判断标准，采用染色强度及染色面积的乘积计算该切片的免疫组化评分(IHS)，最后取5个视野的平均值。

1.6统计学方法数据采用SPSS 1 7.0统计软件包处理，计量资料以(±s)表示，多组间比较应用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1血清NT-P r o BNP结果与空白组比较，模型组NT-Pro BNP含量显著升高(P＜0.05)。与模型组比较，各药物组能够降低NT-Pro BNP，但仍与空白组有差异，各药物组组间比较，低、中剂量组NT-Pro BNP下降无明显差异，高剂量显著优于中剂量(P＜0.05)，见表1。

表1　各组大鼠NT-ProBNP结果比较?χ±s)

2.2HE染色空白组心肌细胞排列整齐，心肌纤维走形清晰，细胞核无深染，胞浆均匀着色，细胞间质无水肿及炎性细胞浸润。模型组心肌纤维走形紊乱，细胞水肿，胞浆着色变浅，胞核出现空泡样及深染改变，可见少量炎细胞；参桂保心浓煎剂高剂量组心肌纤维走形基本正常，心肌细胞有轻度水肿，无炎性细胞浸润，中低剂量组介于高剂量与模型组之间。

3　c a s p a s e-3免疫组化检测

3.1镜下观察空白组大鼠左室心肌细胞仅有极少量标记，散在分布，胞浆呈淡黄色。心衰模型组阳性心肌细胞胞浆染色程度强，呈棕褐色，表达面积广泛，融合。各中药治疗组阳性细胞染色强度及面积均低于模型组，高于空白组，Caspase-3染色强度由强到弱依次为低剂量组(棕褐色，棕黄色)，中剂量组(棕黄色)，高剂量组(黄色)，见图1—3。

图1　免疫组化Ca s p a s e-3空白组（400×）

图3　免疫组化Ca s p a s e-3高剂量组（400×）

3.2免疫组化评分与空白组比较，模型组表达升高(P＜0.05)。与模型组比较，低、中、高剂量组均能够降低Caspase-3表达(P＜0.05)，但组间比较，其下降程度高剂量组优于中剂量组(P＜0.05)，中剂量组优于低剂量组(P＜0.05)，见表2。

表2　各组大鼠免疫组化评分结果比较?±s)　分

4　讨论

研究表明ISO诱导心衰模型，85mg/kg及以上剂量多诱导不可逆性心肌缺血坏死，纤维化及心肌重塑损伤，故在探讨心室重构、炎性介质，细胞凋亡等相关指标时有显著优势［6］。B-型利钠肽(BNP)在心衰的诊断与鉴别诊断、程度分级、评估疗效、指导用药及预测预后有重要意义，2001年已被欧洲心脏病协会列入心衰指南。NT-pro BNP半衰期为BNP的3～6倍，其个体变异小，且与BNP检测方法一致，是更具优势的评价心衰发生、发展的血浆检测指标。Emdin M等［7］研究提示NT-pro BNP对早期轻度心力衰竭的诊断价值高于BNP。Maisel AS等［8］研究表明血浆NT-pro BNP水平与心衰程度密切相关。故该指标可作为检测心衰发生、发展的敏感指标。本实验早期给予参桂保心浓煎剂干预，可降低NT-Pro BNP水平，减轻心肌组织病理形态学变化，改善心功能，尤其高剂量组作用显著。

越来越多研究支持细胞凋亡导致心肌细胞持续低水平的丢失与心力衰竭的发生、发展存在因果关系。在细胞凋亡机制的研究中发现Caspase-3是内源性凋亡通路和外源性凋亡通路最终执行凋亡的主要效应因子，是多种凋亡信号调节的交叉点。研究发现心肌细胞发生凋亡时，caspase-3的表达增加［9］，故抑制Caspase-3的活性可减少凋亡发生［10］。本实验结果表明，在正常健康大鼠心肌内Caspase-3表达较低，当心衰发生时可诱发Caspase-3过度表达，不同剂量的参桂保心浓煎剂均能够抑制Caspase-3表达，其抑制作用高剂量组优于中剂量组，中剂量组优于低剂量组，推测参桂保心浓煎剂的作用机制可能是通过下调Caspase-3表达，阻断细胞凋亡，改善心衰，起到治疗作用。

总之，无论是NT-pro BNP还是Caspase-3，各剂量组虽然能降低其水平或表达，但与空白组之间仍有差距，说明心衰过程体液因子调节机制是错综复杂的，参桂保心浓煎剂治疗心衰的作用靶点研究有待进一步深入。

［1］Sharov VG，Sabbah HN，Shimoyama H，et al.Evidence of cardiocyte apoptosis in my ocardium of dogs with chronic heart failure［J］.Am J Pathol，1996，148（1）：141-149.

［2］Sukumaran V，Watanabe K，Voeroveedu PT，et al.Olmesar tan，an AT1 antagonist，at tenuates oxidative stress，endoplasmic reticulum stress and cardiac inf lammatory mediators in rats with heart fai lure induced by experimental autoimmune myocarditis［J］.International Journal of Biological Science Ter til r l fi li Clciece，2011，7（2）：154-167.

［3］Cryns V，Yuan J.Protease to die for［J］.Genes Dev，1998，12（11）：1551-1570.

［4］Clerico A，Fontana M，Zyw L，et al.Comparison of the diagnostic accuracy of brain natriuretic peptide（BNP）and the N-Terminal part of the propeptide of BNP immunoassays in chronic and acute hear t fai lure：a systematic reviewQWW［J］.Cl in Chem，2007，53（5）：813-822.

［5］许良中，杨文涛.免疫组织化学反应结果的判断标准［J］.中国癌症杂志，1996，6（4）：229-231.

［6］张云.异丙肾上腺素诱导心肌缺血损伤模型的研究进展［J］.医学综述，2010，16（23）：3527-3531.

［7］Emdin M，Passino C，Clerico A.Natriuretic peptide assays revisited：do we need pro-B-type nat riuretic peptide？［J］.J Am Col l Cardiol，2011，57（12）：1396-1398.

［8］Maisel AS，Krishnaswamy P，Nowak RM，et al.Rapid measurement of B-type nat riuretic peptide in the emergency diagnosis of heart fai lure［J］.N Eng J Med，2002，347（3）：161-167.

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Effectsof ShenGui BaoXin Concentrated Decoction
on NT-pro BNP and Caspase-3 of the Ratsw ith Heart Failure

MA Xiaoqing1,2，ZHONG Xu3△，DANG Chanjuan1
1 Gansu University of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730000，China；2 Gansu Province the Third People′s Hospital；3 University Hospital of Gansu Traditional Chinese Medicine

Objective：To explore the effects of ShenGui BaoXin concentrated decoction on NT-pro BNP and Caspase-3 of isoproterenol（ISO）-induced ratmodelw ith leftventricular insufficiency.Methods：Fifty ratswere randomized into themodel group，low，moderate and high doses groupsand the blank group，ten rats each group.The rats in themodelgroup were given the same amountof physiological saline after administered them ISO in the dose inducing heart failure（85mg/kg），the rats of the blank group were unhandled，the other groupswere treated w ith ShenGui BaoXin concentrated decoction in low，moderate and high doses after giving ISO，the contents of NT-pro BNPwere detected by ELISAmethod in eightweeks，myocardialhistomorphologywasobserved by HE staining，the expressions of caspase-3 were detected by immunohistochemicalmethod.Results：1）Compared w ith the model group，the levelof NT-pro BNP decreased in differentmedication groups（P＜0.01），but itwas higher than thatof the blank group obviously（P＜0.01），compared w ith themoderate dose group，therewasno obvious difference in the low dose group（P＞0.05），it lowered in the high dose group significantly（P＜0.01）.2）Compared w ith themodelgroup，the expressionsof Caspase-3 were inhibited in differentmedication groups（P＜0.01），but they were higher than theseof theblank group obviously（P＜0.01），the high dose groupwasstronger than themoderate dose group in the inhibiting effects（P＜0.01），themoderate dose group was stronger than the low dose group（P＜0.05）.Conclusion：ShenGui BaoXin concentrated decoction could decrease the level of NT-pro BNP of ISO-induced ratmodel w ith heart failure and improve heart function，itsmechanism m ight be inhibiting overexpression of Caspase-3 and blocking cellularapoptosis.

heart failure；NT-pro BNP；Caspase-3；ShenGui BaoXin concentrated decoction

R542.22

A

1004-6852（2016）07-0008-04

2016-01-25

吴阶平医学基金会临床科研专项资助基金（编号320.6750.11053）。

马晓庆（1981—），女，硕士学位，主治医师。研究方向：心血管疾病的诊治。

钟栩（1963—），女，教授，主任医师。研究方向：心血管疾病的诊治。