不同前处理对植物酯酶抑制法检测蔬菜中有机磷及氨基甲酸酯类农药残留的影响

姜露，叶麟，杨雪，黎杉珊，申光辉，张志清

(四川农业大学 食品学院，四川 雅安， 625014)



不同前处理对植物酯酶抑制法检测蔬菜中有机磷及氨基甲酸酯类农药残留的影响

姜露，叶麟，杨雪，黎杉珊，申光辉，张志清*

(四川农业大学 食品学院，四川 雅安， 625014)

利用酶抑制法可以快速检测蔬菜中的有机磷和氨基甲酸酯类农药残留，这两类农药能抑制酯酶的活性，并影响酯酶对底物的催化能力。根据这一原理，采用麦麸酯酶作为酶源对酶抑制法快速检测农残前处理方法中农残提取液、提取方法、提取时间及样品提取液的处理方式进行优化。结果表明：用5%丙酮-磷酸盐缓冲液作为提取液，然后超声提取5min后，将样品提取液再用0.45μm有机滤膜过滤后蔬菜中农药残留提取量可达到最高；且样品加标回收率为83.61%～102.81%，变异系数为1.20% ～7.23%。因此，该前处理方法可满足于麦麸酯酶抑制法快速检测农药残留的需要。

麦麸酯酶；酶抑制法；有机磷农药；氨基甲酸酯类农药；蔬菜；前处理方法

农药是重要的农业生产资料，它的使用能有效保障或提高农作物的收成。但是农产品种植中，因缺乏科学使用农药的知识及片面追求高产量，随意并超量使用违禁农药，进而导致食品中的农残超标问题比较突出[1]。摄取的残留农药经过长期累积会对人体造成严重损害，可能诱发基因突变，致使癌变、畸形的比例和可能性大大提高[2]。因此，加强农药残留的检测力度，杜绝农残严重超标的食品流入市场变得尤为重要。

酶抑制法是快速检测农药残留研究较多且较为成熟的一种方法，该法与传统的仪器检测法相比具有检测成本低、耗时短、设备和试剂简单等优点。我国已经将其列入国标，可对农产品中的有机磷及氨基甲酸酯类农药残留进行快速检测[3]。检测用酶主要有来自动物及昆虫的胆碱酯酶和从植物中提取的植物酯酶[4-6]。其中，植物酯酶属于羧酸酯水解酶类，广泛存在于小麦、玉米、大豆等谷物中，与胆碱酯酶相比具有原料易得、成本很低、保存期长等优点[7-8]。在农药残留检测过程中，无论是传统仪器检测法还是快速检测都需要对样品进行前处理。农药残留分析前处理是农残分析检测的关键步骤，它直接关系着整个分析过程的准确性与精密度[9]。有统计表明，大部分传统农药残留检测过程中，需要通过有机溶剂提取、浓缩、净化等前处理步骤，约占整个分析时间的70%左右[10]，在此操作过程中产生的误差也占整个分析误差的绝大多数且无法对廉价的蔬菜进行随时随地的快速检测。

目前，对酶抑制法快速检测农药残留的研究主要是以酶源的筛选及分离纯化为主[12-13]，很少有对其前处理方法进行报道，且研究表明国标中的直接浸提法对农残的提取率并不高[14]。因此，本研究根据酶抑制法快速检测有机磷及氨基甲酸酯类农药的原理，采用麦麸中提取的植物酯酶作为检测酶源，对快速检测方法中前处理过程进行优化，并通过对几种有机磷及氨基甲酸酯类农药进行样品回收率实验验证麦麸酯酶快速检测蔬菜中农药残留的可行性。

1　材料与方法

1.1材料

麦麸酯酶，实验室自制；卷心菜(Brassica oleraceavar.capitata)、小白菜(Brassica rapaL.ChinensisGroup)，雅安市市售。

1.2试剂与仪器

1.2.1试剂

有机磷类农药标准品：敌敌畏(液体1.00mg/mL)、甲基对硫磷(液体1.00mg/mL)、乐果(液体1.00mg/mL)，成都杰锐科技有限公司；氨基甲酸酯类农药标准品：丁硫克百威(液体1.00mg/mL)、西维因(固体纯度≥99.8%)、叶蝉散(固体纯度≥99.8%),成都杰锐科技有限公司；α-乙酸萘酯，上海源叶生物科技有限公司；固兰B盐，上海蓝季科技发展有限公司；HCl，四川西陇化工有限公司；α-萘酚、十二烷基硫酸钠(SDS)、Na2HPO4·7H2O、NaH2PO4·2H2O、无水乙醇，成都市科龙化工试剂厂，所用试剂均为分析纯。

1.2.2仪器

CP225D型电子天平，德国Sartorius股份公司；HS6150D型超声波清洗仪，恒奥科技有限公司；HH-2数显恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；UV-3100型紫外分光光度仪计，上海美谱达仪器有限公司；TS-I平衡脱色摇床，上海亚荣生化仪器厂；Milli-Q型超纯水纯化系统，美国密理博公司。

1.3研究方法

1.3.1麦麸酯酶的制备

从麦麸中提取麦麸酯酶参考杨雪等[15]的方法，并将其稀释5倍待用。

1.3.2蔬菜的预处理

取卷心菜及小白菜的可食部分，用自来水、蒸馏水分别洗涤3次，放在干燥处并用滤纸片擦干备用。

1.3.3蔬菜样品中农药残留的提取方法

用浓度为0.5mg/L的西维因农药喷洒于1g卷心菜上，4 ℃下放置12h。将菜叶剪成1cm2的碎片，放入提取液使其淹没菜叶提取一定时间后，定容到10mL，然后取上清液作为样品提取液待用。

1.3.4样品提取液对酶活抑制率的测定方法

酶活抑制率的测定参考杨雪等[15]的方法，并稍作修改，于试管中加入4.25mL的样品提取液，再加入0.25mL麦麸酯酶，混匀后在35℃恒温水浴锅中反应30min。取出试管加入0.25mL浓度为(8×10-4)mol/L的α-乙酸萘酯溶液，40 ℃恒温水浴5min后加入0.25mL质量分数4.2%SDS，再加入0.25mL质量分数0.03%固兰B盐摇匀，最后加入0.25mL体积分数20%HCl溶液摇匀后读取吸光度值A1，作为实验组。用提取液替代样品提取液做为对照组A0，以未加α-乙酸萘酯溶液组做空白对照，其他操作与样品提取液测定方法相同，通过测得的吸光度值计算酶活抑制率。

酶活抑制率公式：

式中：A0，对照组的吸光度值；A1，实验组的吸光度值。

1.3.5农药标准曲线

6种农药先用丙酮分别配制成10mg/L的标准储备液，然后用磷酸盐缓冲液(pH7.2，0.2mol/L)将敌敌畏、叶蝉散稀释成0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00mg/L系列浓度；西维因稀释成0.05、0.10、0.25、0.50、1.00mg/L系列浓度；乐果、甲基对硫磷稀释成1.00、1.20、1.40、1.60、1.80、2.00mg/L系列浓度；丁硫克百威稀释成0.10、0.16、0.25、0.50、0.72、1.00mg/L系列浓度，然后按照1.3.4方法将样品提取液替换成不同浓度的农药进行测定。并计算不同浓度农药对麦麸酯酶酶活的抑制率，然后以农药浓度的对数为横坐标，相应的抑制率为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.6蔬菜中农药残留提取液的选择

分别配制不同体积分数的丙酮磷酸盐缓冲液(0%、5%、10%、20%)，按照1.3.3的实验方法将不同浓度的丙酮磷酸盐缓冲液替代样品提取液测定麦麸酯酶酶活吸光度值，考察不同浓度的丙酮对酯酶酶活的影响，从而确定丙酮的最佳浓度。并将该浓度下的丙酮缓冲液、pH7.2的磷酸盐缓冲液、质量分数5%NaCl作为蔬菜中农残的提取液，从中选择最适宜的提取液。

1.3.7不同提取方法及提取时间的确定

实验采用振荡法和超声波法对蔬菜中的农药残留分别进行提取，振荡法提取时提取时间为5、10、15、20、25、30min，而超声波法提取时间分别为1、3、5、7、9、12min,将上清液静置5～10min后取上清液按照1.3.4的方法测定，考察不同提取方法及不同提取时间对农药回收率的影响。

1.3.8样品提取液不同处理方法的比较

样品提取液在测定前的不同处理方式也会对检测结果产生一定的影响，本实验以卷心菜和小白菜为例，在最佳的提取方法基础上分别对这2种蔬菜的样品提取液进行直接测定、活性炭吸附后过滤、0.45μm有机滤膜过滤3种不同的处理方法，取上清液按照1.3.4的方法测定，考察不同处理方法对农药回收率的影响。

1.3.9农药加标回收率的测定

将各农药配制成浓度为10mg/L的标准工作液，然后分别取0.25、0.5、1.0mL的敌敌畏、叶蝉散、西维因、丁硫克百威标准工作液和1.0、1.5、2.0mL的乐果、甲基对硫磷的标准工作液喷洒于1g卷心菜叶上，放置过夜，按照上述确定的最佳提取方法提取并测定酶活抑制率作为实验组。并将同一批次购买未喷洒农药的卷心菜同样加入提取液进行提取，测定酶活抑制率作为空白值，然后根据农药浓度与抑制率的标准曲线计算加标回收率。

2　结果与分析

2.1农药标准曲线的绘制

由表1可知，6种农药在系列浓度范围内均呈现良好的线性关系，其相关性均在0.98以上。

表1　农药浓度与麦麸酯酶抑制关系

注：y:抑制率，%；x: 农药浓度对数(lgc)(c为农药质量浓度，mg/L)。

2.1应用于酯酶抑制法检测农残的蔬菜中农残提取液的确定

2.1.1丙酮含量对麦麸酯酶酶活性的影响

用pH7.2的磷酸盐缓冲液将丙酮稀释成不同体积浓度，然后测定丙酮对麦麸酯酶酶活的影响，并用吸光度值来表示，吸光度值越高说明麦麸酯酶酶活性越大。由图1可知，当磷酸盐缓冲溶液中丙酮含量为5%时，麦麸酯酶酶活性变化不大，差异不显著(P>0.05)。但是随着丙酮含量的增加，麦麸酯酶酶活迅速减小(P<0.05)，说明当丙酮含量过高时会抑制麦麸酯酶的活性,原因可能是一方面极性有机溶剂如丙酮可溶解大量的水并剥去酶保持活性的必需水，从而使酶失去活性；另一方面可能是由于丙酮可通过破坏酶蛋白活性构型的氢键、疏水作用等而使酶变性失活。因此，在提取蔬菜中的农药残留时提取液中丙酮的体积分数不得超过5%。

图1　不同含量丙酮对麦麸酯酶酶活吸光度值的影响Fig.1　Effect of different concentrations on the activity of wheat bran esterase

2.1.2蔬菜中农药残留提取液的确定

经上述实验筛选出的磷酸盐缓冲液和体积分数5%的丙酮磷酸盐缓冲液和质量分数5%的NaCl盐溶液作为蔬菜中农药残留的提取液，从而选出最佳的农残提取液。由图2可知，含有5%丙酮的磷酸盐缓冲液提取后的样品提取液农药残留回收率最大，而使用5%NaCl溶液和磷酸盐缓冲液提取后的样品提取液回收率差异不显著( P>0.05),而且这2种样品提取液的回收率均显著(P<0.05)低于含有丙酮的缓冲液。原因可能是由于农药多属于有机化合物，不易溶于水，而溶于丙酮、石油醚等有机溶剂。所以用含有丙酮的缓冲液提取样品中的农药效果比磷酸盐缓冲液和氯化钠盐溶液要好。因此，选择5%的丙酮磷酸盐缓冲液作为蔬菜中农药残留提取液。

图2　不同提取液对回收率的影响Fig.2　Effect of different extracting solution on the recovery of pesticide

2.2样品提取时间的选择

2.2.1振荡法提取时间的确定

提取方法是指用溶剂将待测样品中农药溶解、分离出来的操作步骤。利用上述实验确定的提取液采用振荡的方法进行提取，比较不同的提取时间回收率的影响。由图3可知，振荡时间在5～25min时回收率逐渐升高，当提取时间大于25min后随着提取时间的延长回收率基本趋于平稳，差异不显著(P>0.05)。说明振荡时间太短时，蔬菜上的农药不能完全被提取出来。所以，采用振荡法提取农药时将25min作为最佳的提取时间。

图3　振荡提取时间对回收率的影响Fig.3　Influence of oscillation extraction time on the recovery

2.2.2超声波法提取时间的确定

采用了超声波法提取蔬菜中的农药残留，并对2种提取方法进行对比。结果如图4可知，当提取时间在1～5min时回收率迅速升高(P<0.05)，随着时间的延长回收率呈现缓慢下降的趋势。这是因为随着提取时间的延长蔬菜中的农药被完全提出，但是提取时间过长会使提取液温度升高、细胞破碎导致提取液里有效充分发生变化，色素类物质开始溶出，影响检测结果。所以，采用超声波法提取农药残留时最佳的提取时间是5min。

图4　超声波提取时间对回收率的影响Fig.4　Influence of ultrasonic extraction time on the recovery

由图3和图4可以看出，2种提取方法的酶活抑制率都随着提取时间的延长增加。但超声波法在最佳提取时间下的农残回收率显著(P<0.05)高于振荡法，说明超声波法要优于振荡法，这是由于振荡提取只能提取出菜叶表面的农药残留，而不能将叶片内部残留的农药提取出来。而且超声所用的提取时间远远低于振荡提取法，所以选择超声波法提取蔬菜中的农药残留，最佳提取时间为5min。

2.3样品提取液处理方式的确定

将超声波提取5min后的卷心菜和小白菜样品提取液分别进行直接测定、活性炭吸附后过滤、 0.45μm有机滤膜过滤3种不同的处理方法进行处理。结果由表2可知，从卷心菜中提取的样品提取液经直接测定和0.45μm滤膜过滤后回收率差异显著(P>0.05)，但是均显著大于活性炭吸附后的回收率。说明从卷心菜上提取的样品提取液过0.45μm有机滤膜与直接测定对测定结果没有影响。这主要是因为卷心菜颜色浅，质地较硬，样品提取液无色透明不浑浊，所以在检测时对透光率影响小。而从小白菜中提取的样品提取液经过3种处理方式后测定的结果差异均显著(P<0.05)，其中过0.45μm有机滤膜后的回收率明显要高于其他两种处理方式。这可能是因为小白菜颜色为翠绿色，质地软，细胞破碎程度大，因此经超声波提取的样品提取液颜色深且浑浊，而有机滤膜可过滤掉大分子物质，如蛋白质、附着有色素的粗纤维等，不影响小分子的物质(农药)通过，提取液变澄清透明。无论在卷心菜还是小白菜中利用活性炭吸附后的回收率均低于滤膜过滤的，原因一方面可能是活性炭在吸附杂质时也吸附了部分农药，另一方面是由于其吸附效果不如滤膜，因此测得的结果偏低。所以，在检测颜色较浅的蔬菜时对样品提取液可直接测定，而那些颜色较深的蔬菜样提取液需采用0.45μm有机滤膜过滤掉样品提取液中的杂质。

表2　样品提取液处理方式对农药回收率的影响　%

2.4样品回收率实验

加标回收率是衡量农药残留量分析方法准确度和可靠性的指标。为了验证麦麸酯酶检测蔬菜中6种农药残留方法的可行性，将每种农药由小到大配制成3种不同的浓度进行了加标回收实验。结果表明该单标样品回收率在83.61%～102.81%之间，回收率测定值的变异系数小于7.23%(表3)。说明按照上述试验方法处理后测得的回收率均比较高，即该方法检测蔬菜残留的农药效果较好。

表3　卷心菜中6种农药的加标回收率

3　结论

本研究依据酶抑制法快速检测农药残留的方法以麦麸酯酶为检测用酶，在农残检测的最佳条件下通过对麦麸酯酶酶活抑制率的测定，对蔬菜中的农药残留提取的前处理进行优化，得到了一组最优前处理方法。即用体积分数5%丙酮磷酸盐缓冲液作为提取液，然后超声波法提取5min后，将样品提取液再用0.45μm有机滤膜过滤。并用该方法检测蔬菜中农药残留的加标回收率和变异系数，按照本方法处理后测得的回收率比较高且变异系数均在10%以内，也进一步证明了该方法的准确性。通过本实验前处理方法的优化，即可以节省前处理用时，又不失检测的精确性与稳定性。

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Effectofdifferentpre-treatmentmethodsondetectionresultsoforganophosphateandcarbamatepesticideresiduesinvegetablesbyplantesteraseinhibitionmethod

JIANGLu,YELin,YANGXue,LIShan-shan,SHENGGuang-hui,ZHANGZhi-qing*

(CollegeofFoodScience,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an625014，China)

Theactivityofesterasecanbeinhibitedbyorganophosphateandcarbamatepesticideresidues.Theabilityoftheesterasetocatalyzethesubstratecanalsobereduced.Usingthisprinciple,theoptimizationsofpesticideresidueextractionsolution,extractingmethods,extractiontimeandthetreatmentofsamplesolutionwereseparatelydonebyusingwheatbranenzymeinhibitionmethod.Theresultsshowedthattheoptimalwaytoextractpesticidesresiduesinvegetableswas5%acetone/PBSextracting5minbyultrasonic,thenfilteredwith0.45μmorganicfilm.Withtheabovepre-treatmentmethods,theresponseraterangedfrom83.61%to102.81%,withcoefficientofvariationattherangedfrom1.2%to7.23%.Therefore,thispre-treatmentcanmeettheneedofrapiddetectionofpesticideresidues.

plantesterase;enzymeinhibition;organophosphoruspesticide;carbamatepesticide;vegetables;pre-treatmentmethod

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601037

硕士研究生(张志清教授为通讯作者，E-mail:zqzhang)。

2015-07-02，改回日期：2015-09-01