HPLC法测定蜂蜜中羟甲基糠醛的不确定度评定

鹿　剑， 任水英

(1 新疆特种设备检验研究院, 新疆　乌鲁木齐　830011；2 国家农副产品监督检验中心(新疆)，新疆　乌鲁木齐　830011)



HPLC法测定蜂蜜中羟甲基糠醛的不确定度评定

鹿剑1， 任水英2

(1 新疆特种设备检验研究院, 新疆乌鲁木齐830011；2 国家农副产品监督检验中心(新疆)，新疆乌鲁木齐830011)

建立了高效液相色谱法测定蜂蜜中羟甲基糠醛的不确定度评定方法。分析了不确定度的主要来源，并对各个分量进行了量化，评定出本方法测定羟甲基糠醛的不确定度为1.7 mg/kg。方法准确、客观，在实际工作中有较强的实用性。

不确定度评定；羟甲基糠醛；高效液相色谱法

羟甲基糠醛是蜂蜜中的氨基化合物与葡萄糖在酸性条件下发生Mailard反应或者蜂蜜中还原糖发生脱水反应产生的物质[1]。羟甲基糠醛的含量是评价蜂蜜及其制品的重要指标[2]，因此其准确的测定有着重要的意义。评价测量结果有效的方法是测定不确定度的评定[3]。本文对采用高效液相色谱法测定蜂蜜中羟甲基糠醛的含量进行了不确定度评定。

1　测量原理

试样经称样定容，过滤后进高效液相色谱仪，经反相色谱柱分离后，测定羟甲基糠醛的含量，根据保留时间和峰面积进行定性和定量。

2　实　验

2.1主要仪器与试剂

Waters 2695系列高效液相色谱仪，美国沃特世公司；New classic MF电子分析天平：梅特勒托利多公司；ULUP-Ⅱ超纯水仪：开普勒公司。

羟甲基糠醛标准物质，Sigma公司；甲醇(HPLC级),美国Fisher公司；实验用水为超纯水。

2.2标准溶液的制备

精密称取10 mg 羟甲基糠醛标准物质，用甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，得到标准储备液。分别移取适量标准储备液，用纯水稀释定容至100 mL，得到质量浓度为2.0,4.0, 6.0, 10.0 μg/mL的系列标准工作溶液。

2.3样品前处理

准确称取蜂蜜产品10 g(精确至0.01 g),加适量甲醇超声约10 min，转移至100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm的滤膜过滤，待测。

2.4色谱条件

色谱柱：Hypersil ODS色谱柱(4.6 mm×200 mm, 4.6 μm)；流动相：甲醇-水(40:60,V/V)；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：285 nm；进样量：10 μL。

3　不确定度分量的主要来源及其分析

高效液相色谱法测定羟甲基糠醛的不确定度主要有以下几个来源：一是样品称量时天平带来的不确定度；二是样品定容时溶液体积带来的影响；三是最小二乘法标准曲线拟合带来的不确定度。

4　数学模型

试样中羟甲基糠醛含量的计算公式为：

式中：X——试样中羟甲基糠醛的含量，g/kg

m1——进样体积中羟甲基糠醛的质量，μg

m—— 试样质量，g

V——试样稀释液总体积，mL

V1——进样体积，μL

5　不确定度分量

5.1试样质量m

标准要求称样质量为10.00 g，所用天平分辨力为0.01 g；按矩形分布原则，称样时天平分辨力带来的不确定度为：

JJG539-1997《数字指示秤》规定，该准确级的天平最大允许误差为±0.005 g，按矩形分布原则，称样时由天平的最大允许误差导致的样品质量不确定度为：

将上述两个分量合成，则：

urel(m)=0.006455/10=0.0006455

5.2试样稀释液总体积V

(1)温度

样品处理液定容时环境温度为(26 ± 2) ℃。温度变化同时会引起溶液体积和容器容积的变化。由于水的体积膨胀系数远大于容器容积的膨胀系数，因此可以忽略温度对容器容积与玻璃量器校准时的温度有差距。水的体积膨胀系数为2.1×10-4℃-1，试样稀释液总体积V=100 mL，按照矩形分布原则，温度对体积测量的影响为：

(2)容量瓶校准

由JJG 196-2006《常用玻璃量器检定规程》可知，100 mL容量瓶(A级)最大允差为 ± 0.10 mL，按三角分布估计，于是由此引入的不确定度分量为:

将上述两个分量合成，则：

urel(V)=0.06336/100=0.0006337

5.3进样体积中羟甲基糠醛的质量m1

(1)羟甲基糠醛标准溶液浓度

由标准物质证书提供其相对标准不确定度为0.5%，由此引入的相对标准不确定度分量为U1(m1)=0.005。

(2)通过最小二乘法得到校准曲线计算进样体积中羟甲基糠醛的质量

配制出质量浓度为2.0,4.0, 6.0, 10.0 μg/mL四个校准标准溶液，用最小二乘法拟合校准曲线。由于校准标准溶液质量浓度的不确定度小到足够可以忽略，因此采用最小二乘法拟合校准曲线时，计算得到的食品中羟甲基糠醛含量m1的不确定度仅与色谱峰面积的测量不确定度有关，而与校准标准溶液的不确定度无关。同时也不考虑校准标准溶液质量浓度之间的相关性。对四个校准标准溶液各测量三次，共计12次。测量得到的色谱峰面积A,见表1。

表1　校准标准溶液的峰面积测定结果

拟合校准曲线的方程为：

Ai=B0+B1m1i

式中：Ai——色谱峰面积

m1i——校准标准溶液进样体积中羟甲基糠醛的质量

B0——拟合校准曲线的截距

B1——拟合校准曲线的斜率

由下式可得B0和B1分别为：

由下式可得色谱峰面积测量的实验标准差为：

对样品处理液中的羟甲基糠醛共测量六次，即p=6。测得样品处理液进样体积中羟甲基糠醛的质量m1=0.01836 μg。于是其标准不确定度u2(m1)为:

其相对标准不确定度U2(m)为：

U2(m1)=u2(m1)/m0=0.0008352/0.01836=0.04549

将上述两个分量合成，则:

5.4进样体积V1

该方法为相对定量方法，根据试样稀释液与标准溶液的响应值(峰面积)之比来定量。由于试样稀释液与标准溶液的进样体积V1相同，其产生的不确定度已相互抵消。

将各测量不确定度分量汇总如表2所示。

表2　测量不确定分量汇总表

6　合成不确定度

试样中羟甲基糠醛含量的平均值为X=18.37 mg/kg

最后得到:

uc(X)=ucrel(X)×X=0.04576×18.37=0.8406 mg/kg

7　扩展不确定度

取包含因子K为2，扩展不确定度:

u(X)=0.08406×2=1.6812 mg/kg

8　不确定度报告

试样中羟甲基糠醛含量为18.37 mg/kg，标准要求保留两位有效数字，所以饮料中羟甲基糠醛含量不确定度报告为：(18.4±1.7) mg/kg，包含因子K=2。

[1]刘静，曹炜. 蜂蜜中羟甲基糠醛的研究进展[J].中国蜂业,2011,62(1):11-12,35.

[2]龙光明，裘璐，马丽等. HPLC测定6种蜂蜜中5-羟甲基糠醛的含量[J].数理医药学杂志，2012,25(6):643-645.

[3]刘建冲,朱家平,郑荣华. 测量不确定度评定研究现状及进展[J].现代科学仪器，2013(5):12-17.

Uncertainty Evaluation in the Determination of 5-Hydroxymethylfurfural in Honey by HPLC

LU Jian1, REN Shui-ying2

(1 Xinjiang Uygur Autonomous Region Inspection Institute of Special Equipment, Xinjiang Urumqi 830004;2NationalQualitySupervisionTestCenterofAgriculturalByproducts(Xinjiang),XinjiangUrumqi830004,China)

A method of uncertainty evaluation was developed for the determination of 5-Hydroxymethylfurfural (HMF) in honey by high performance liquid chromatography (HPLC). Main factors contributing to the uncertainty were analyzed and quantified, and the uncertainty of HMF was synthesized as 1.7 mg/kg. The method is accurate and objective, and it could be applied in practice.

uncertainty evaluation; HMF; high performance liquid chromatography (HPLC)

鹿剑(1975-)男，高级工程师，主要从事特种设备检验工作。

任水英(1981-)，女，高级工程师，主要从事食品质量监督和科研开发工作。

TS207.3

A

1001-9677(2016)016-0155-03