万古霉素联合穿心莲内酯对金黄色葡萄球菌生物膜的作用

祝司霞， 程 君， 杜小丽

·论著·

万古霉素联合穿心莲内酯对金黄色葡萄球菌生物膜的作用

祝司霞， 程 君， 杜小丽

目的 观察万古霉素和穿心莲内酯联用对金黄色葡萄球菌（金葡菌）生物膜形成的影响。方法 体外构建金葡菌生物膜模型；XTT减低法评价万古霉素和穿心莲内酯联用对金葡菌生物膜初始黏附能力的影响；镜下观察药物对金葡菌生物膜的形态学影响。结果 1 000、500、250 mg/L的穿心莲内酯和各个浓度（2 MIC、1 MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC）的万古霉素对金葡菌生物膜的早期黏附有抑制作用； 1 MIC万古霉素和穿心莲内酯联合的抑制作用比单用万古霉素强；250 mg/L的穿心莲内酯和1 MIC万古霉素联用使细菌生物膜形态结构被显著破坏。结论 一定浓度的穿心莲内酯和万古霉素对金葡菌生物膜的形成和黏附均有抑制作用，且二者恰当联用可能具有协同作用。

万古霉素； 穿心莲内酯； 金黄色葡萄球菌； 生物膜

据美国国立卫生研究院（NIH）统计，超过80%细菌性疾病与细菌生物膜有关［1］。细菌生物膜是细菌附着在有生命或无生命物质表面后，由细菌及其所分泌的胞外多聚物（主要是胞外多糖）共同组成的膜状细菌群体，是细菌为了适应周围环境而形成的一种保护性生存方式。自然界中绝大部分细菌以生物膜的方式存在，细菌生物膜最显著的特征是具有很强的黏附能力和抗药性，其对抗菌药物的耐药性可以增加到浮游菌的1 000倍［2］，而且生物膜中的细菌可逃避宿主的免疫攻击，致使其能在宿主体内长期存在，使感染迁延不愈。目前国内外抗生物膜治疗主要侧重于不断研发新的抗菌药物，但应用于临床的抗生素和化学合成药物具有一定的毒性作用，具生物膜细菌对这些常规药物容易产生耐药性，耐药菌株有不断增加的趋势。有研究表明中药和抗生素联合应用有减量增效的优势［3］。本研究通过在体外建立金黄色葡萄球菌（金葡菌）生物膜模型，观察中药穿心莲内酯和万古霉素对金葡菌生物膜的作用，从而为中药和西药联合应用治疗金葡菌感染提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株 攀枝花学院附属医院和中心医院检验科于2014年6—9月分离得到的40株金葡菌临床菌株，用刚果红平皿法筛选出生物膜阳性菌株。对照菌株为金葡菌ATCC25923，购自中国药品生物制品检定所。

1.1.2 培养基 血琼脂平皿（青岛日水生物技术有限公司，产品编号：20140630）；胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）（青岛日水生物技术有限公司，批号：20140228）；刚果红平皿（刚果红0.8 g/L，脑心浸液干粉37 g/L，葡萄糖5 g/L，琼脂20 g/L，氯化钠40 g/L。用双蒸水配制）。

1.1.3 药物及试剂 盐酸万古霉素标准品（上海励瑞生物科技有限公司，货号：0990）；穿心莲内酯标准品（中国食品药品检定研究院，110797-201108）；XTT（合肥博美生物科技有限责任公司，批号：112073-21-1）；维生素K3（VK3，合肥博美生物科技有限责任公司）；刚果红（合肥博美生物科技有限责任公司）；脑心浸出液肉汤（BHI）（广东环凯微生物科技有限公司，批号：3102439）；磷酸盐缓冲液（PBS）（氯化钠8 g，氯化钾0.2 g，磷酸氢二钠1.44 g，磷酸二氢钾0.24 g，调pH 7.2，定容1 L，高压蒸汽灭菌，室温保存）；林格液（氯化钠9 g，氯化钾0.12 g，氯化钙0.24 g，蒸馏水1 000 mL ），所用试剂均为国产分析纯。

1.1.4 仪器与材料 GH4500型隔水式培养箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；DG5031型酶联免疫检测仪（华东电子集团医疗装备有限责任公司）；YJ-875型医用净化工作台（苏州净化设备公司）；手提式高压蒸汽灭菌器（上海三申医疗器械有限公司，20110936）；101-2AB型电热鼓风干烤箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；96孔细胞培养板（合肥博美生物科技有限责任公司，产品编号：HC044）；盖玻片（江苏世泰实验器材有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 筛选实验菌株 参照文献［4］，将从临床获得的40株金葡菌，接种在血平皿上，分离单个菌落，再将单个菌落接种于刚果红平皿。37 ℃培养24 h后，再在温室放置72 h。菌落变为黑色并出现结晶为生物膜阳性株，不产生生物膜的菌落仍然为红色。

1.2.2 万古霉素对金葡菌的MIC测定 参照文献［3-4］ ，将实验菌株接种于TSB中，于37 ℃培养8 h，菌液用TSB稀释成D650nm值为0.1的菌悬液。培养基中加入药物万古霉素，用TSB连续稀释，使培养液中的药物浓度依次为8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 mg/L。每管加入D650 nm值为0.1的菌悬液200 μL。空白对照管（只加TSB，不加细菌和药物）、阴性对照管（只加TSB菌液，不加药物），37 ℃培养24 h，观察各个试管是否出现浑浊，并与空白和阴性对照比较，以未出现浑浊管的最低药物浓度作为万古霉素的MIC。

1.2.3 金葡菌生长量测定 根据周薇等［5］、王业梅等［6］的方法并略作改进，将实验菌株接种于TSB中，于37 ℃增菌培养18 h，菌液用TSB稀释成D650nm值为0.1的菌悬液，每孔取100 μL接种于96孔板中，37 ℃培养 0、2、6、8、24 h（每个时间设12个复孔），分别测定其D650nm值，弃去培养基与悬浮菌，蒸馏水清洗3次，56 ℃干燥1 h，1%结晶紫染色15 min，蒸馏水清洗3次，分别测定其D650 nm值。

1.2.4 穿心莲内酯和万古霉素对金葡菌黏附抑制试验 参照文献［7］，取D650 nm值为0.1的TSB菌液（接种环挑3～5个菌落，接种于4～5 mL的TSB中，35 ℃孵育4 h，增菌后的菌液用TSB校正浓度，使其D650 nm值为0.1，100 μL接种入96孔板中于37 ℃分别培养0、1、2、4 h，弃去悬浮菌，PBS清洗 3次，加入用TSB为稀释液对倍稀释配制的穿心莲内酯（1 000、500、250、125、62.5 mg/L）和万古霉素（2 MIC、1 MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC）溶液各100 μL（每个浓度设8个复孔）；另设5组万古霉素联合穿心莲内酯（125 mg/L穿心莲加入2 MIC万古霉素，250 mg/L穿心莲加入2 MIC万古霉素，125 mg/L穿心莲加入1 MIC万古霉素，250 mg/L穿心莲加入1 MIC万古霉素， 500 mg/L穿心莲加入1 MIC万古霉素）、空白对照孔（只加TSB，不加细菌和药物）、阴性对照孔（只加TSB、菌液，不加药物）各100 μL（每个浓度设8个复孔）。再于37 ℃培养24 h，加入XTT溶液（林格液稀释为0.5 mg/L，0.22 μm孔径的滤膜过滤除菌，临用前加入VK3）100 μL ，37 ℃避光培养2 h，分别测定各孔D650 nm值。

1.2.5 观察穿心莲内酯和万古霉素对金葡菌生物膜形态结构的影响 参照文献［8］将灭菌的盖玻片浸在D650 nm值为0.1的TSB菌液中，培养3 d（每天换1次菌液），使之形成生物膜模型，再分别加250 mg/L的穿心莲内酯、1 MIC的万古霉素、250 mg/L的穿心莲内酯加入1 MIC的万古霉素（每天换1次药液），作用3 d，另设阴性对照（只加TSB菌液，不加药物）。用镀银染色法（用灭菌生理盐水多次充分漂洗经上述处理的盖玻片，去掉浮游菌，在2.5%戊二醛PBS溶液中固定1 h，蒸馏水清洗1 min，饱和氯化钙溶液结合15 min，蒸馏水清洗1 min，5%硝酸银溶液反应15 min，1%对苯二酚溶液显色2 min，蒸馏水清洗1 min，5%硫代硫酸钠溶液固定2 min，蒸馏水清洗1 min。）显微镜（1 000 倍）观察各模型形态的变化，根据其形态结构的变化判断药物的作用效果 。

1.2.6 统计学处理 实验数据应用SPSS 19.0软件处理，对相关数据进行统计分析。采用t检验组间比较，数据以± s表示，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 金葡菌生长量测定

经过筛选，在40株临床分离株中，有12株为生物膜阳性菌株，余为阴性，选择1株生物膜强阳性菌株做实验（结晶紫法测膜生长量），该菌株对万古霉素的MIC值为2 mg/L。培养基中金葡菌的生长量随着时间的增长呈上升趋势，而黏附到96孔板上金葡菌的数量基本没有太大变化。结果见图1。

2.2 金葡菌黏附抑制试验

与阴性对照孔相比，穿心莲内酯在浓度125 mg/L和62.5 mg/L时作用0、1、2 h对金葡菌黏附均无抑制作用（P＞0.05），而其他浓度的穿心莲内酯在0、1、2、4 h对金葡菌的黏附均有抑制作用（P ＜0.05）。与阴性对照孔相比，2、1、1/2、1/4和1/8 MIC的万古霉素在0、1、2、4 h内对金葡菌黏附均有明显抑制作用（P＜0.001）。但1/8 MIC万古霉素对金葡菌黏附能力的影响几乎和1 MIC效果一致，使用2 MIC时才出现更强的抑制效果；穿心莲内酯和万古霉素联合用药时，每个浓度组合都对金葡菌黏附有抑制作用（P＜0.001），但1 MIC万古霉素和穿心莲内酯联合用药抑制作用比单独用药加强，2 MIC万古霉素和穿心莲内酯联合用药的效果却远低于单用万古霉素，见图2，3，4。

图1 金葡菌及其生物膜生长量曲线图（n =12，± s）Figure 1 Growth curves of S. aureus and the corresponding biofilm formation（ n = 12， mean ± SD）

图2 不同浓度的穿心莲内酯对金葡菌黏附能力的影响（n =8，± s）Figure 2 Effect of andrographolide at different concentrations on the adhesion ability of S. aureus cells（ n=8， mean ± SD）

图3 不同浓度的万古霉素对金葡菌黏附能力的影响（n =8，± s）Figure 3 Effect of vancomycin at different concentrations on the adhesion ability of S. aureus cells（ n =8， mean ± SD）

2.3 药物对金葡菌生物膜形态结构的影响

镜下观察，金葡菌在TSB培养3 d时形成密集的生物膜。与对照组相比，250 mg/L的穿心莲内酯作用3 d后，密集的生物膜被破坏；1 MIC万古霉素作用3 d后，对生物膜的形成有显著抑制作用；250 mg/L的穿心莲内酯和1 MIC万古霉素联用3 d后，生物膜的破坏更加明显，见图5。说明穿心莲内酯和万古霉素使金葡菌生物膜形态结构发生明显变化，对金葡菌生物膜的形成有抑制作用。

图4 不同浓度的穿心莲内酯和万古霉素联用对金葡菌黏附能力的影响（n =8，± s）Figure 4 Effect of vancomycin in combination with andrographolide at different concentrations on the adhesion ability of S. aureus cells（ n=8， mean ± SD）

图5 镀银染色观察金葡菌在不同条件下的生长状况（×1 000）Figure 5 Growth of S. aureus strain under different conditions， observed after silver staining （×1 000）

3 讨论

与浮游细菌相比，有生物膜的细菌具有极强的耐药性和抵抗机体免疫系统的作用，常引起许多慢性和难治性感染性疾病如慢性呼吸道、泌尿系统感染、感染性心内膜炎、龋齿、牙周炎等；另外，新型生物材料的应用日益增多，如人工关节、人工瓣膜等，一旦被细菌生物膜污染，它们被植入体内就会导致感染和移植的失败，给人类健康带来了严重的危害。因此细菌生物膜已成为全球关注的重大难题，如何防治细菌生物膜成为目前备受关注的研究领域。

金葡菌是以生物膜形式感染的常见病原菌之一。有报道，近年来内置物金葡菌感染生物膜形成发生率显著增加，93.5%创伤慢性难愈合创面检出金葡菌生物膜感染［9］。侵入机体的金葡菌可以黏附于宿主细胞形成生物膜，由于其中的绝大多数细菌处于静止或休眠状态，药物不易渗入，导致感染菌难以清除，所以寻找有效的抗金葡菌生物膜的药物迫在眉睫。

目前国内外对抗细菌生物膜的抗生素大多具有一定的毒性作用，且耐药菌株不断增加。而我国有丰富的中药资源，某些中药具有抗菌消炎的功效，且毒性作用小，较少出现耐药性，但杀菌作用弱，起效慢。已有实验证实，通过中西药联用可以发挥药物减量增效的作用，可以更好地控制生物膜菌引起的相关感染［10］。

穿心莲内酯是从中药穿心莲中提取出来的一种主要有效成分，具有清热解毒、抗菌消炎、免疫调节、抗肿瘤等多种功效。临床上被用于治疗上呼吸道感染、急慢性支气管炎、肺炎、细菌性痢疾、脑膜炎、尿路感染、中耳炎、牙周炎、感冒发热等疾病。研究表明，穿心莲内酯对金葡菌无直接杀菌作用，但对其生物膜具有良好的抑制作用，且与其他抗生素联用有协同杀菌作用［11-12］。万古霉素具有强大的对抗金葡菌作用，所以本实验采用穿心莲内酯和万古霉素联合用药的方式来对抗细菌生物膜。

结果显示：在黏附方面，穿心莲内酯除了125 mg/L和62.5 mg/L浓度外，其他浓度在0、1、2、4 h对金葡菌的黏附均有抑制作用，研究发现1 MIC万古霉素和穿心莲内酯联合用药抑制作用比单独用万古霉素加强，但2 MIC万古霉素和穿心莲内酯联合用药的效果却远没有单用万古霉素好，所以穿心莲内酯和万古霉素联合用药是否具有协同抑制黏附作用还有待于进一步研究；在形态结构方面，250 mg/L的穿心莲内酯对生物膜有破坏作用，1 MIC万古霉素对生物膜的形成有显著抑制作用，250 mg/L的穿心莲内酯和1 MIC万古霉素联用对生物膜的破坏更加明显。

虽然本实验初步证明了万古霉素和穿心莲内酯有抑制细菌生物膜的作用，但仍需要进一步研究论证，比如可以进行体内生物膜试验，从基因和分子水平揭示药物的作用机制等。此外，为制定出更有效的防治感染性疾病的策略，建议针对慢性难治性病例，要进行生物膜检测，以确定是否有生物膜的相关感染，从而评估病情和确定最佳治疗方案，但目前尚缺乏有效检测手段；如何制定抗生物膜的有效标准也是亟待解决的医学问题。

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Effects of vancomycin in combination with andrographolide on the biofilm formation of Staphylococcus aureus

ZHU Sixia， CHENG Jun， DU Xiaoli. （Department of Morphology， Medical College of Panzhihua University，Panzhihua Sichuan 617000， China）

Objective To observe the effects of vancomycin in combination with andrographolide on the biofilm formation of Staphylococcus aureus. Methods The in vitro model of Staphylococcus aureus biofilms was constructed. XTT reduction assay was used to evaluate the effects of vancomycin in combination with andrographolide on initial adhesion capability of Staphylococcus aureus biofilm. Microscope was used to observe the morphology of the biofilm after treatment. Results Andrographolide inhibited the early adhesion of Staphylococcus aureus at 1 000， 500 and 250 mg/L when combined with different concentrations of vancomycin （2 MIC， 1 MIC， 1/2 MIC， 1/4 MIC， and 1/8 MIC）. The concentration of 1 MIC vancomycin in combination with andrographolide inhibited adhesion significantly stronger than vancomycin alone. Andrographolide 250 mg/L plus 1 MIC vancomycin significantly destroyed the morphology and structure of the biofilms. Conclusions Andrographolide plus vancomycin at certain concentration can inhibit the biofilm formation and adhesion of Staphylococcus aureus. Their appropriate combination is likely to have a synergistic effect.

vancomycin； andrographolide； Staphylococcus aureus； biofilm

R378.11

A

1009-7708（2016）02-0189-05

10.16718/j.1009-7708.2016.02.011

2015-04-02

2015-09-14

攀枝花学院大学生创新创业训练计划项目（2014cxsy089）。

四川省攀枝花学院医学院形态学教研室，四川攀枝花 617000。

祝司霞（1973—），女，硕士，讲师，主要从事医学微生物学教学与科研。

祝司霞，E-mail： pzhu001@126.com。