文冠果叶抑制人肝癌细胞HepG2增殖和抗氧化活性部位的筛选△

张严磊，施欢贤，雷莉妍，宋忠兴，唐志书

(陕西中医药大学 陕西省中药资源产业化协同创新中心 陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 712083)

·基础研究·

文冠果叶抑制人肝癌细胞HepG2增殖和抗氧化活性部位的筛选△

张严磊，施欢贤，雷莉妍，宋忠兴，唐志书*

(陕西中医药大学 陕西省中药资源产业化协同创新中心 陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 712083)

目的：研究文冠果叶不同萃取物的抗氧化及抗肝癌活性。方法：分别用水、30%乙醇水溶液、50%乙醇水溶液、70%乙醇水溶液及95%乙醇水溶液萃取文冠果叶，得到5个不同的提取部位A、B、C、D、E，采用MTT法筛选对人肝癌细胞HepG2增殖抑制作用的活性部位；抗氧化活性部位通过DPPH·清除试验筛选。结果：A、B、C、D、E 5个部位皆有一定的抗肿瘤活性和抗氧化活性，其中抗肝癌活性最强的是部位D，样品质量浓度为2.5 mg·mL-1时，部位D对人肝癌细胞HepG2增殖抑制率为74.27%；抗氧化活性最强的是部位E，当质量浓度为0.2 mg·mL-1时，其对自由基DPPH·清除率高达85.78%。结论：文冠果叶具有对人体有益的功效，适合开发为保健茶、化妆品等。

文冠果叶；抗氧化；抗肝癌活性

文冠果XanthocerassorbifoliaBunge是无患子科(Sapindaceae)文冠果属(Xanthoceras)木本油料植物，一属一种，为中国特有的民间植物[1]。文冠果原产中国西北地区，主要分布在陕西、山西、河北、内蒙古等省，具有较高的食用、药用价值。其根茎、叶、花、果实皮等均可入药[2]。有祛风、消肿止痛等功效，临床上主要用于治疗风湿性关节炎、风湿内热、皮肤风热、小儿遗尿等症[3]。果壳提取物被证明具有改善记忆及抗老年痴呆的功效，其主要活性物质为文冠果壳苷[4]。

文冠果适应性很强，耐干旱、瘠薄，根系发达，萌蘖力强，生长快、结实早、产量高、寿命长、经济价值大，是珍贵的观赏兼重要的木本油料树种。目前文冠果被国家列为木本油料作物主要树种，其选育推广受到国家高度重视，大力发展文冠果势在必行。目前，全国已有文冠果栽培面积达25万公顷[5]。文冠果叶是文冠果产业发展过程中不可忽视的一个部分，产量巨大，民间用其嫩叶代替茶饮使用，市售有文冠果叶茶相关产品。研究表明文冠果叶含有多种化学成分[6]，且民间一直相传其具有多种养生保健作用，诸如降脂、降压、降血糖等，但是相关药理活性研究报道很少，几乎没有文献支持。本文对文冠果叶抗氧化及抗肿瘤活性进行初步的探索研究，为文冠果资源的综合开发利用提供科学依据与理论支持。

1 材料

1.1 药材

新鲜的文冠果叶(杨凌普天农业科技有限公司)，通风处阴干、粉碎过4目筛备用。

1.2 细胞株

人肝癌HepG2细胞株(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)。

1.3 药品与试剂

DMEM培养基(美国HyClone公司)；胎牛血清(浙江天航生物科技有限公司)；双抗(北京索莱宝科技有限公司)；0.25%胰蛋白酶(美国HyClone公司)；抗坏血酸(Vc)(成都科龙化工试剂有限公司)；1，1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH·)标准品(Sigma公司，纯度为99%)；1.10-邻二氮菲(一水)(成都科龙化工试剂有限公司)；95%乙醇、无水乙醇、去离子水等试剂及溶剂均为分析纯。

1.4 仪器

UV-2600紫外分光光度计(日本岛津)；Zirbus Technology LTD-Vaco真空冷冻干燥机(香港嘉盛科技有限公司)；DZKW-4型电子恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

2 方法

2.1 样品制备

取新鲜的文冠果叶1000 g，阴干、粉碎后留用；分别加入3倍量的蒸馏水，30%、50%、70%及95%的乙醇水溶液，加热回流3次，每次3 h，合并提取液，提取液浓缩后冷冻干燥得不同的样品活性部位A、B、C、D、E备用。

2.2 抗肝癌活性部位筛选

2.2.1 HepG2细胞的培养 将HepG2细胞置于25 mL塑料培养瓶中，加入完全高糖DMEM培养基(含10%胎牛血清，100 U·L-1青霉素和100 mg·L-1链霉素)，置于37 ℃含5% CO2的恒温培养箱内。待细胞生长至90%汇合时，用0.25%的胰酶消化传代，3 d传代1次。

2.2.2 MTT法检测细胞相对存活率 HepG2细胞以1×104个/孔的密度接种于96孔板中，培养12 h使细胞充分贴壁。弃去培养基，分别加入不同浓度的文冠果叶水提部位、30%乙醇水提取部位、50%乙醇水提取部位、70%乙醇水提取部位及95%乙醇水提取部位。在细胞培养结束前4 h，每孔加入15 μL的MTT。培养结束后，吸去培养基，每孔加入150 μL的DMSO，37 ℃振荡10 min，用多功能酶标仪检测450 nm处的吸光度值。

2.3 抗氧化活性部位筛选

2.3.1 DPPH·标准溶液的配制 精密称取DPPH·标准品12 mg，用甲醇溶解并定容至250 mL，低温避光保存，备用。临用前用甲醇稀释2倍测量其吸光度。

2.3.2 Vc及样品的溶液制备 分别量取Vc和样品25 mg，用甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶。分别精密量取上述溶液适量，依次用甲醇稀释至质量浓度分别为0.01、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg·mL-1的样品溶液。

2.3.3 实验方法 取2 mL的DPPH·标准液与2 mL甲醇溶液混匀，常温避光反应15 min，于517 nm处测量吸光度(A空白)，用各浓度样品溶液代替甲醇测量其吸光度(A样)，阳性对照参照样品方法。

DPPH·清除率(%)=(A空白-A样)/A空白×100%

(1)

3 结果

3.1 文冠果叶不同提取部位对人肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用筛选结果

由图1可以可知，A、B、C、D、E 5个部位皆有一定的抑制人肝癌细胞HepG2增殖的活性，其中C、D、E即50%、70%和95%乙醇水提部位有较强的活性。当样品质量浓度大于1 mg·mL-1时，部位C、D、E的活性明显，且与质量浓度之间呈良好的量效关系；当样品质量浓度为2.5 mg·mL-1时，部位C、D和E的细胞增殖抑制率分别为69.57%、74.27%和64.5%，部位D是抑制人肝癌细胞HepG2增殖最强的部位。

注：A.水提部位；B.30%乙醇水提部位；C.50%乙醇水提部位；D.70%乙醇水提部位；*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。图1 文冠果叶各活性部位对人肝癌细胞HepG2存活率的影响

3.2 文冠果叶不同提取部位抗氧化活性筛选结果

由图2可知，来源于文冠果叶的部位A、B、C、D、E，对DPPH·自由基均有一定的清除活性，其中部位E清除DPPH·自由基活性最强，在质量浓度为0.2 mg·mL-1时对DPPH·自由基清除率可达85.78%，确定部位E为文冠果叶抗氧化活性最强部位。

A.水提取部位；B.30%乙醇提取部位；C.50%乙醇提取部位；D.70%乙醇提取部位；E.95%乙醇提取部位。图2 文冠果叶各活性部位清除DPPH·的活性

4 结论

文冠果叶不同提取部位A、B、C、D、E皆有一定的抑制人肝癌细胞HepG2增殖的活性和抗氧化活性，其中抗肝癌活性最强的是部位D，样品浓度为2.5 mg·mL-1时，部位D对人肝癌细胞HepG2增殖抑制率为74.27%；抗氧化活性最强的是部位E，当浓度0.2 mg·mL-1时，其对自由基DPPH·清除率高达85.78%。本研究结果为文冠果资源的综合开发和利用提供了一定的科学依据与理论支持。

[1] 周荣汉.中药资源学[M].北京：中国医药科技出版社，1993：331-339.

[2] 商辉，孙妍.文冠果的化学成分和药理作用研究进展[J].中国药房，2015，26(30)：4316-4320.

[3] 王颖，姜生，孟大利，等.文冠果的化学成分与生物活性研究进展[J].现代药物与临床，2011，26(4)：269-273.

[4] 迟天燕，王力华，纪雪飞，等.文冠果壳苷对侧脑室注射Aβ1-42 致小鼠学习记忆障碍的改善作用[J].中国医科大学学报，2009，38 (10)：734-736.

[5] 申登峰.甘肃省文冠果产业发展分析[J].草业科学，2010，27(5)：157-160.

[6] 马养民，王佩.文冠果叶化学成分的研究[J].中成药，2010，32(10)：1750-1753.

ScreeningofInhibitionofProliferationofHumanHepatocellularCarcinomaCellLineHepG2andAntioxidantActivityPartsofXanthocerassorbifoliaLeaf

ZHANGYanlei，SHIHuanxian，LEILiyan，SONGZhongxing，TANGZhishu*

(ShanxiUniversityofChineseMedicine/ShanxiCollaborativeInnovationCenterofIndustrializationofTraditionalChineseMedicineResources；ShanxiKeyLaboratoryofNewDrugsandBioactiveConstituentsofTraditionalChineseMedicine,Xianyang712083，China)

Objective：To study the antioxidant and antitumor activity of different extracts ofXanthocerassorbifolialeaves.Methods：Water，30%，50%，70%，and 95% ethanol aqueous were used to extract leaves ofX.sorbifolia，and five different fractions A，B，C，D and E were obtained，MTT method was used to screen the antitumor part on the proliferation of human hepatoma cell line HepG2；antioxidant parts was screed by DPPH radical-scavenging ration.Results：Five different fractions all showed certain antitumor and antioxidant activity，part D with the strongest anti-tumor activity，when the sample concentration was 2.5 mg·mL-1，its inhibition rate could up to 74.27%；the strongest antioxidant activity part was E.When the concentration was 0.2 mg·mL-1，the free radical DPPH radical scavenging rate was as high as 85.78%.Conclusion：The leaf ofX.sorbifoliawith beneficial effects for human beings，is suitable to develop products as health tea and cosmetics.

Xanthocerassorbifolialeaves；antioxidant；antitumor activity

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.11.013

2016-01-07)

陕西省协同创新计划项目(2015xt-52)；陕西省科技资源开放共享平台项目(2015FWPT-01)

*

唐志书，教授，研究方向：中药资源化学；E-mail：tzs6565@163.com