Box-Behnken响应曲面法筛选金银花中抗流感病毒活性成分研究△

邱玲玲，肖莹，支星，袁淑琴，马宁，王建芬*

(1.长沙医学院 药学院，湖南 长沙 410000；2.九江职业大学 护理学院，江西 九江 332900)

·基础研究·

Box-Behnken响应曲面法筛选金银花中抗流感病毒活性成分研究△

邱玲玲1，2，肖莹2，支星2，袁淑琴2，马宁1，王建芬1*

(1.长沙医学院 药学院，湖南 长沙 410000；2.九江职业大学 护理学院，江西 九江 332900)

目的：辨识金银花中抗流感病毒活性成分，并探讨各活性成分间的相互作用关系与优化配比。方法：以流感病毒神经氨酸酶活性抑制率为表征，采用Box-Behnken响应曲面法进行设计研究。结果：发现金银花中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸-A具较明显抗病毒活性，相互关系研究表明绿原酸与隐绿原酸之间存在拮抗作用，新绿原酸对其他组分具有协同作用；经模型预测及验证得到优化配比为新绿原酸-绿原酸-隐绿原酸-异绿原酸-A(10 μg·mL-1∶21.028 μg·mL-1∶216.85 μg·mL-1∶52.88 μg·mL-1)，较金银花作用更强。结论：实验结果可为新型抗流感病毒活性神经氨酸酶抑制剂研究提供参考。

抗流感病毒；响应曲面法；金银花；活性成分；神经氨酸酶抑制剂

从流感病毒H1N1的流行到现今H7N9出现，流感病毒已造成了对人类健康的重大危害，对社会和谐稳定和世界经济发展构成了巨大威胁[1]，如何有效防治流感病毒是全球医药研发的重大课题和巨大挑战。中药在预防和治疗流感的实践中积累了丰富的临床经验，中药及其复方也因其“多组分、多靶点、多效应、不易耐药”的特点在流感治疗中发挥着日益重要的作用[2]。金银花为忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或初开的花，具清热解毒、疏散风寒的功效，已广泛应用于抗流感病毒、抗菌的临床治疗中，疗效确切，且药效物质相对明确[3]。本研究以抗流感病毒活性神经氨酸酶(neuraminidase，NA)抑制率为指标，采用Box-Behnken响应曲面法(BBD)进行设计研究，辨识金银花的抗病毒活性成分，以明确主要及相关药效成分，探讨各成分间相互作用关系，预测抗病毒优化配比，以期为金银花组分中药的筛选提供研究基础，为新型NA抑制剂研究做好铺垫。

1 材料与仪器

1.1 药材与试剂

绿原酸(批号：FY14351025)、新绿原酸(批号：FY14380315)、隐绿原酸(批号：FY14390310)、异绿原酸-A(批号：FY14400329)、棕榈酸(批号：FY18491202)、灰毡毛忍冬皂苷乙(批号：FY13290912)、咖啡酸(批号：FY13810623) 、木犀草素(批号：FY14650427)、药材金银花(JYH)(为忍冬花蕾，产自山东临沂平邑)等均购于南通飞宇生物科技有限公司；流感病毒NA(批号：SLBM0746V)(来源于产气荚膜梭菌)和MUNANA (批号：SLBM6111V)均购于sigma公司；磷酸奥斯他韦酸颗粒(Ostw，宜昌东阳阳光长江药业股份有限公司)；甘氨酸、氯化钙(西陇化工股份有限公司)。

1.2 仪器

Spectra Max M4荧光酶标检测仪(美国Molecular Devices公司)；恒温细胞培养箱；96孔荧光酶标板(美国Costar公司)。

2 方法

采用经典的的荧光酶标法[4]，以NA抑制率(I%)为指标进行研究。

反应抑制率(I%)=[(酶活性对照荧光-底物空白组荧光)-(样品测试组荧光-样品背景组荧光)]/(酶活性对照荧光-底物空白组荧光)×100%

(1)

3 结果与讨论

3.1 金银花抗流感病毒活性成分的辨识

采用单因素考察法考察金银花中各单体成分对NA活性的抑制作用。研究对象包括金银花主要成分[5-6]：新绿原酸(A)、绿原酸(B)、隐绿原酸(C)、异绿原酸-A(D)、棕榈酸(E)、灰毡毛忍冬皂苷乙(F)、咖啡酸(G)及木犀草素(H)，并以磷酸奥斯他韦酸为阳性药进行对照比较。研究发现E、F、G和H未表现出较明显的NA抑制作用；而A、B、C和D 4个化合物表现出较为明显的NA抑制活性，且在一定浓度范围内呈明确的量效关系(见图1)。因此初步认为这4个化合物可作为金银花抗流感病毒活性成分。

注：JYH代表金银花水提物，相当于金银花药材的质量浓度，单位为g·mL-1。图1 单因素法考察金银花中各成分对NA活性抑制作用结果

3.2 金银花抗流感病毒活性成分优化配比预测与评估

通过对金银花抗流感病毒主要活性成分筛选的研究，采用BBD法对抗流感病毒活性较强的A、B、C和D 4个成分在低、中、高3个浓度水平(依次标记为-1、0、+1)进行优化研究，共计29次实验，因素水平见表1，实验设计及结果见图2。

表1 基于BBD法的金银花抗流感病毒成分因素水平表

图2 基于BBD法的金银花抗流感病毒成分筛选实验设计及结果

用Design-Expert软件对上述29次BBD实验数据进行多元线性回归分析，建立金银花活性成分A、B、C和D与NA抑制率I%关系的数学模型，所得多元线性回归方程为：

I%=71.371 1-7.162 5×A+12.063 3×B+13.209 2×C+1.930 0×D+7.430 0×AB+5.412×AC+2.320 0×AD-13.620 0×BC-1.610 0×CD-4.862 4×B2-8.141 2×C2-4.464 9×D2

(2)

经方差分析和显著性检验，各因素对抑制率I%值的贡献率差异较大(见表2)。

表2 方差分析和显著性检验结果

注：*P<0.05；**P<0.01。

据F值大小提示这4个成分对NA抑制作用强弱依次为C>B>A>D，且A、B和C对NA抑制率I%值的影响具有统计学意义(P<0.01)，相比而言D虽然对NA抑制作用表现为不显著，其中B和C均与I%值表现为正相关，公式(2)显示两者联合使用时表现为BC的系数为负数，推测B和C之间表现为相互拮抗的关系，联合使用应注意比例协调，减弱拮抗作用；A与I%值虽表现为负相关，但A分别与B、C及D联用时系数却为正数，尤其是与组分AB对NA的抑制率较为显著(P<0.05)，推测A为成分B 、C 、D的协同增效成分。组分CD与I%值表现为负相关，认为C和D之间可能存在拮抗减效作用。

根据上述模型方程，一阶偏导求解方程得到金银花抗流感病毒活性组分的最优配比(ZJPB)为新绿原酸-绿原酸-隐绿原酸-异绿原酸-A(10μg·mL-1∶21.028 μg·mL-1∶216.85 μg·mL-1∶52.88 μg·mL-1)，模型预测其NA抑制率为82.57%，按预测的最佳配比验证得到实际NA抑制率为84.64%，与模型预测值仅相差2.07%，将最优配比与各成分单独抑制NA比较，以金银花为参照(以绿原酸含量计算)，结果如图3所示。结果表明最优配比抑制作用较4个单体成分单独使用抑制作用的总和更强，说明组分间成分发挥协同增效作用。与金银花相比，最佳配比的抑制作用更强。

图3 单体成分及最佳配比抑制NA作用比较

目前用于流感病毒治疗的药物虽较多，但随着流感病毒的变异以及耐药毒菌的出现，许多药物即将或是已经被淘汰[7-8]，因此新的抗流感病毒药物的研发已经非常迫切，抗流感病毒筛选的方法也被广泛应用。现用于抗流感病毒筛选的方法主要有体内和体外实验法[9-11]，如MTT比色法，红细胞凝集活性检测法，流感病毒感染的小鼠肺炎模型实验法。荧光酶标法是流感病毒NA活性体外检测常用方法之一。由于NA是影响流感病毒复制、感染和致病的关键酶，NA抑制剂已经成为抗流感病毒的一线药物，因此近年来该法已发展为抗流感病毒药物的筛选和活性评价的重要方法[12-13]。

BBD法具有普筛高效、预测准确等优势[14-15]，适合用于快速发现中药活性成分研究和组分中药的初步探索。本研究基于BBD法，在药效活性系统表征的基础上筛选得到的药效组分，成分清晰、机制明确，为流感疫情的防治及NA抑制剂的新制剂研究提供参考，为有效推进现代组分中药的发展提供技术支持。契于组分中药多组分、多环节、多靶点作用特点，对抗流感病毒各关键靶点深入体内、外试验以确认初筛的活性成分将是后续研究工作的重心所在。

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ScreeningActiveIngredientsofLoniceraeJaponicaeFlosagainstInfluenzaBasedonBox-BehnkenResponseSurfaceMethod

QIULingling1，2，XIAOYing2，ZHIXing2，YUANShuqin2，MANing1，WANGJianfen1*

(1.Collegeofpharmacy，ChangshaMedicalUniversity，Changsha410219，China；2.CollegeofNursing，JiujiangVocationalUniversity，Jiujiang332000，China)

Objective：This study aimed to screen active ingredients of Lonicerae Japonicae Flos dry flower buds against influenza，so that the interaction relationship between the active ingredient could be objectively assessed and the proportioning ratio could be optimized.Methods：The antiviral effect on neuraminidase activity of influenza virus was applied as the evaluating indicator and Box-Behnken response surface methodology was used in the experiment.Results：The results indicated that chlorogenic acid，cryptochlorogenic acid，isochlorogenic acid-A and neochlorogenic acid were the main active ingredients of Lonicerae Japonicae Flos.Antagonistic action existed between chlorogenic acid and cryptochlorogenic acid，whereas synergistic action between neochlorogenic acid and other ingredients.By dynamic simulation and verification，the optimum proportioning ratio was as follows：neochloroge-nic acid：chlorogenic：acid-cryptochlorogenic acid：isochlorogenic acid-A (10μg·mL-1∶21.028 μg·mL-1∶216.85 μg·mL-1∶52.88 μg·mL-1)，which is stronger than that of Lonicerae Japonicae Flos.Conclusion：The results was reliable，which could provide foundation for the research of new type NA inhibitors.

Anti-influenza virus；response surface methodology；Lonicerae Japonicae Flos；active ingredients；neuraminidase inhibitors

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.11.014

2016-04-17)

湖南省教育厅科学研究项目(13C1130)

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王建芬，讲师，研究方向：中药分析；E-mail：qlfcsj@163.com