土槿皮乙酸抗肝癌机制研究△

钟婷，薛变变，王增艳，王莹，刘春禹，于静华，胡冬华*

(1.长春中医药大学 药学院 药物化学教研室，吉林 长春 130000；2.吉林大学 白求恩第一医院 胃肠内科，吉林 长春 130000；3.吉林大学 白求恩第一医院 呼吸内科，吉林 长春 130000；4.长春中医药大学 附属医院 针灸科，吉林 长春 130000；5.吉林大学 白求恩第一医院 艾滋病与病毒研究所，吉林 长春 130000)

土槿皮乙酸抗肝癌机制研究△

钟婷1，薛变变2，王增艳3，王莹2，刘春禹4，于静华5*，胡冬华1*

(1.长春中医药大学 药学院 药物化学教研室，吉林 长春 130000；2.吉林大学 白求恩第一医院 胃肠内科，吉林 长春 130000；3.吉林大学 白求恩第一医院 呼吸内科，吉林 长春 130000；4.长春中医药大学 附属医院 针灸科，吉林 长春 130000；5.吉林大学 白求恩第一医院 艾滋病与病毒研究所，吉林 长春 130000)

目的：在细胞水平研究土槿皮乙酸(PAB)抗人肝癌细胞(HepG2)的机制。方法：以4 μmol·L-1PAB分别处理12、24、36、48 h后，通过细胞计数法确定PAB的抑制率；通过细胞形态学观察确定PAB是否诱导细胞死亡；划痕实验观察PAB对肝癌细胞转移的影响；荧光染色法检测PAB处理后HepG2细胞中微管聚集情况；Real-time PCR检测PAB对P53基因转录的影响；Western blot检测相关蛋白表达。结果：PAB时间依赖性地抑制HepG2 细胞的生长，并且诱导HepG2细胞的死亡；有效降低肝癌细胞的转移；促进细胞骨架蛋白聚集；降低P53基因转录，并调控P53蛋白和P27蛋白表达。结论：PAB对体外培养的HepG2 细胞生长有明显的抑制作用，并且通过调控微管分布来抑制细胞转移。

土槿皮乙酸；人肝癌HepG2细胞；细胞增殖；细胞转移

据报道，肝癌容易复发并且转移率高。目前，临床上抗肝癌复发与转移的治疗措施主要有放射介入、全身化疗，由于患者大多有慢性肝病背景，任何一种放疗、化疗方案都伴有明显的不良反应。所以中药在抑制肿瘤细胞增殖、稳定瘤体生长、改善症状体征、减毒增效、预防复发、提高生存质量、延长生存期等方面具有独特的优势。

土槿皮为松科植物金钱松的干燥根皮或近根树皮，土槿皮乙酸(Pseudolaric acid B，PAB)是从土槿皮中分离得到的新型二萜酸化合物。有研究表明土槿皮乙酸具有抗肿瘤[1-4]、抗血管生成[5]、抗微管[6-7]等药理作用。本实验探讨土槿皮乙酸的抗肝癌作用及其作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

土槿皮乙酸(PAB)购于中国食品药品检定研究院，应用时用二甲基亚砜(DMSO)溶解，并使DMSO的终浓度低于0.01%。胎牛血清购自北京元亨圣马生物试剂公司；DAPI、Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate、二甲基亚砜(DMSO)为Sigma公司产品；Trizol reagent和Glycogen为Invitrogen公司产品；Anchored Oligo(dT)18、2×ES Reaction Mix、RNase-free Water为北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司产品；SYBR GREEN(ABI，USA)为ABI公司产品；Histone、P53、Tubulin、P27抗体及相应的二抗购自Santa Cruz Biotec公司(CA，USA)；DMEM培养基(Thermo Fisher Scientific，USA)。

1.2 细胞培养

细胞单层接种在含10%胎牛血清和4.0 mmol·L-1谷氨酰胺的DMEM培养液中，在37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养。

2 方法

2.1 细胞生长的抑制

取对数生长期的HepG2细胞接种于直径3.5 cm的培养皿中。随机分为用药组和对照组，用药组培养液中分别加入用DMSO溶解的4 μmol·L-1PAB，对照组(Con)培养液中加入与治疗组等量的DMSO，再分别培养12、24、36、48 h后，用台盼兰染色后立即对细胞进行计数，计算药物对肿瘤细胞的抑制率。

2.2 细胞形态学变化

将细胞接种于培养皿中，至细胞进入对数生长期后，加入4 μmol·L-1PAB，培养12、24、36、48 h后在显微镜下观察细胞形态的变化。

2.3 细胞骨架的变化

对HepG2细胞进行爬片培养，然后换为终浓度为4 μmol·L-1的PAB培养液培养，并设对照，置CO2培养箱中分别孵育12、24、36、48 h后，将爬片好的细胞用4%多聚甲醛固定细胞10 min，PBS洗5 min，0.8% TritonX-100穿孔15 min，PBS洗两次，加入5 μg·mL-1的Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate对其进行细胞骨架染色40 min，PBS漂洗多次，每次5 min，DAPI染色15 min，封片剂封片后在荧光显微镜下观察细胞骨架的变化。

2.4 Real-time PCR

收集PAB(4 μmol·L-1)处理12、24、36、48 h后的PAB组和对照组细胞，取200 μL样品到1.5 mL离心管中，加入1 mL Trizol，用手振摇15 s，再在室温加入200 μL三氯甲烷，静置5 min后，12 000 g、4 ℃离心17 min，离心取上层水相(勿混中层沉淀)，加入新离心管中(事先加入1 μL Glycogen)，再加入0.5 mL异丙醇(4 ℃预冷)，摇匀，-20℃静置30 min，12 000 g、4 ℃离心10 min，弃上清液，加入4 ℃预冷的75%乙醇水溶液1 mL，7500 g、4 ℃离心5 min，弃上清液，待完全干燥10 min后加入30 μL DEPC水溶解得到mRNA产物。再根据反转录试剂盒使用说明书对以上所得的mRNA进行反转录，反应体系的总体积为20 μL，体系的反应条件为42 ℃孵育30 min，85 ℃加热5 min失活。最后根据所得的产物CDNA进行定量PCR，体系的总体积为20 μL，每个样均重复3次。以上操作过程中所加试剂及模板的量均是一致的。P53基因的引物序列和扩增产物的长度见表1，反应中GAPDH作为内部参照。

表1 基因的引物序列度和产物长度

2.5 检测相关蛋白的表达

以PAB浓度为4 μmol·L-1分别处理细胞12、24、36、48 h后，用胰酶消化收集细胞，置于冰上；加入细胞裂解液及蛋白酶抑制剂混合液，吹打均匀，冰上放置5 min，加入上样5×样品缓冲液混匀后于沸水浴中煮沸1 h。再14 000 r·min-1、离心5 min后又混匀，上样，用western blot法检测目标蛋白。

2.6 统计分析

如无特殊提示，所有实验结果均得自3次独立实验，采用t检验进行统计分析。

3 结果

3.1 PAB抑制HepG2细胞增殖

PAB(4 μmol·L-1)作用细胞12、24、36、48 h后，对HepG2细胞的细胞毒作用呈明显的时间依赖性(图1 A、B)。

注：A.细胞抑制率；B.细胞数目。图1 PAB抑制HepG2细胞增殖图

3.2 PAB对HepG2细胞形态的影响

PAB(4 μmol·L-1)处理细胞以后，观察到正常对照组(Con)细胞形态正常完整，细胞连接紧密，有较少数细胞死亡；而PAB组细胞数目明显减少，浮起变圆，出现细胞死亡，见图2。

注：Bar=15 μm。图2 PAB对HepG2细胞形态的影响

3.3 PAB抑制肝癌细胞的转移

PAB作用12、24、36、48 h 后，对照组细胞间划痕随着时间的迁移消失，而PAB组划痕依然存在。所以PAB抑制肝癌HepG2细胞的迁移，见图3。

注：↔表示划痕宽度。图3 PAB抑制HepG2细胞的转移情况

3.4 PAB对肝癌细胞Tubulin的影响

对照组细胞生长密集，细胞呈梭形、三角形、或不规则形；胞核圆形或椭圆形、核膜完整、界限清晰；胞质密度高、不透明、胞膜连续；红色的微管蛋白均匀分布。而经PAB处理后的实验组细胞稀疏、形态不规则；微管蛋白(红色荧光)聚集在胞核周，并聚集成束状，而细胞周的微管蛋白表达显少(荧光淡)、透明度高。从DAPI细胞核染色可明显看到，与对照组相比，PAB处理后实验组的细胞出现了较多的双核、甚至多核细胞，见图4。

图4 PAB对微管的影响

3.5 PAB对P53基因转录的影响

在PAB处理12、24、48 h时，4 μmol·L-1PAB上调P53基因的mRNA水平，但在36 h与对照组比较，PAB下调P53基因的mRNA水平，见图5。

注：* P<0.05，**P<0.01。图5 PAB对P53基因转录的影响

3.6 PAB对P53蛋白表达的影响

从蛋白表达可以看到，4 μmol·L-1PAB分别作用不同时间以后，相比于对照组，细胞中的P53的表达在12、24、36 h减少，但在48 h时，其蛋白表达量明显增加。P27是P53蛋白下游蛋白，其与P53蛋白具有相同的趋势，见图6。

图6 PAB处理HepG2细胞后不同时间点P53和P27蛋白的表达情况

4 讨论

迄今为止，对PAB抗肿瘤机制的研究已有了很大的进展，但对其抗肿瘤细胞增殖和转移的研究较少，导致其还未应用于临床。因此，本课题对PAB抑制肿瘤增殖、抑制肿瘤细胞转移的作用及其机制进行了初步探讨，这将为开发PAB为抗肿瘤药物奠定基础。

4.1 PAB抑制HepG2细胞的生长

恶性肿瘤具有无限增殖生长的特征，抑制肿瘤细胞的快速增殖，一方面可以抑制其生长进程，另一方面也有效地抑制肿瘤的转移(肿瘤细胞生长到一定大小后开始转移)[8]。从细胞计数实验中，我们发现PAB有效地抑制肿瘤细胞生长，其抑制率最高达到了95%。在PAB作用期间，对照组细胞迅速生长，而PAB处理组细胞数目随着处理时间的延长而减少，说明在PAB处理过程中有细胞的死亡，而无限增殖则说明肝癌的恶性度很高。为了验证PAB促进细胞死亡这一点，我们进行了细胞形态学分析，我们发现从12 h 开始，PAB处理组细胞浮起变圆并开始死亡。所以PAB通过诱导细胞死亡执行肿瘤抑制作用。

4.2 PAB抑制HepG2细胞转移

肿瘤细胞转移后会出现癌症细胞扩散的现象，本来可以手术切除的肿瘤组织，却因为肿瘤细胞的转移而无法完成，所以在评价抗肿瘤药物的时候，抑制肿瘤细胞转移是非常重要的指标[8-9]。我们研究发现对照组细胞转移能力强，而PAB可以有效抑制肝癌细胞的转移，说明PAB除了通过抑制细胞增殖来抑制细胞转移外，还可以直接抑制肿瘤细胞转移。而肝癌的迅速转移进一步证明肝癌恶性程度高。

4.3 PAB干预HepG2微管功能

微管蛋白是细胞的骨架蛋白，决定着细胞增殖、细胞转移等细胞机能。在发现PAB抑制细胞增殖和转移后，我们进一步探讨了其对细胞微管蛋白的影响，以确定PAB通过干扰微管功能来影响细胞增殖和转移。我们发现从12 h起，PAB处理的细胞，微管分布不均呈纤维状分布，并且随着时间的延长细胞核出现多核性，所以我们得到这样的假说：PAB毒害了微管的功能，使其没有力量来完成向两极牵拉的细胞分裂功能来完成细胞分裂过程，进而导致多核细胞的形成，这也是其抑制细胞增殖的原因。同时由于微管毒性作用，细胞微管也没有足够的能量来完成细胞移动，进而抑制细胞的转移。

4.4 PAB对P53基因转录及P53蛋白表达的调控

P53蛋白是细胞内重要的蛋白，其参与细胞死亡、细胞周期、细胞转移等方面。本课题观察了PAB对其转录和蛋白表达的影响来进一步探讨PAB作用机制。我们发现PAB处理后增加了P53基因的转录，尽管在36 h有所降低。而我们在观察P53蛋白表达的时候却发现在36 h前，PAB处理却降低了P53蛋白的表达，在48 h时又增加P53蛋白表达。 同时我们观测了P53下游蛋白P27的表达，发现P27蛋白的表达趋势和P53一致。所以我们推测PAB处理后，一致努力增加P53蛋白的表达，直到48 h时得以实现。而PAB处理后P53蛋白在转录水平和蛋白水平的不一致则说明了多个因素参与了P53蛋白的表达。PAB从多个角度执行抗肿瘤作用，是潜在的抗肝癌药物。

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Anti-tumorEffectofPseudolaricAcidBonHepatocellularCarcinomaHepG2CellLine

ZHONG Ting1，XUEBianbian2，WANGZengyan3，WANGYing2，LIUChunyu4，YUJinghua5*，HUDonghua1*

(1.MedicinalChemistry，CollegeofPharmacy，ChangchunUniversityofChineseMedicine，Changchun130021，China2.DepartmentofGastroenterology，TheFirstHospitalofJilinUniversity，Changchun130021，China3.DepartmentofInternalMedicine，TheFirstHospitalofJilinUniversity，Changchun130000，China4.Acupuncturedepartment，TheaffiliatedhospitaltoChangchunUniversityofChineseMedicine，Changchun130021，China5.ResearchInstituteofvirologyandAIDSresearch，ThefirsthospitalofJilinUniversity，Changchun130021，China)

Objective：The aim of this study was to investigate the anti-tumour role of pseudolaric acid B(PAB)on hepatocellular carcinoma HepG2.Methods：Cell counting analysis confirmed the inhibitory ratio of PAB.The morphological changes were observed by phase contrast microscopy.Scratch test was applied for cell immigration.Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate staining was performed for tubulin polymerization.Real time PCR detected the p53 transcription.Western blot was used for protein expression.Results：The inhibitory role of PAB was in time dependent manner.PAB treatment induced the cell death.Cell immigration was inhibited by PAB treatment.Intervening α-tubulin polymerization was visualized after PAB treatment.Real-time PCR test confirmed that PAB treatment inhibited the transcription of p53 gene.And western blot analysis found that PAB regulated the expression of P53 and P27 protein.Conclusion：Therefore PAB had anti-tumor effect on HepG2 through various mechanisms.

Pseudolaric acid B(PAB)；hepatocellular carcinoma HepG2；cell proliferation；cell immigration

2015-04-21)

国家自然科学基金(81301416)；吉林省科技厅重点科技攻关项目(20140204004YY)；国家博士后基金(2014M561302)

*

胡冬华，副教授，研究方向：药物化学和肿瘤分子药理学，Tel：(0431)86045208，E-mail：hudonghua8888@126.com;于静华，医师，研究方向：肿瘤分子药理学和病毒学，Tel：(0431)88783235，E-mail：yjh-0-2002@ 163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.2.005