岗梅根、茎体外抗呼吸道病毒的作用比较研究△

陈炜璇，韩正洲，仰铁锤，马庆，詹若挺，谈英*，陈蔚文*，张奉学

(1.华润三九医药股份有限公司，广东 深圳 518110；2.广州中医药大学 中药资源科学与工程研究中心 岭南中药资源教育部重点实验室，广东 广州 510006；3.广州中医药大学 热带医学研究所，广东 广州 510405)

岗梅根、茎体外抗呼吸道病毒的作用比较研究△

陈炜璇1，2，韩正洲1，2，仰铁锤1，马庆1，詹若挺2，谈英1*，陈蔚文2*，张奉学3

(1.华润三九医药股份有限公司，广东 深圳 518110；2.广州中医药大学 中药资源科学与工程研究中心 岭南中药资源教育部重点实验室，广东 广州 510006；3.广州中医药大学 热带医学研究所，广东 广州 510405)

目的：观察比较岗梅根和岗梅茎水提物对多种呼吸道病毒的抑制作用，为岗梅药材扩大药用部位提供参考。方法：分别接种甲1型流感病毒FM1株、呼吸道合胞病毒、鼻病毒R14型、腺病毒3型和副流感病毒3型于MDCK、A549、HEL和LLC-MK2细胞，采用鸡红血球凝集法观察岗梅根、茎水提物对甲1型流感病毒FM1株的抑制作用，采用细胞病变抑制法(CPE)观察岗梅根、茎水提物对呼吸道合胞病毒、鼻病毒R14型、腺病毒3型和副流感病毒3型的抑制作用。结果：在无毒浓度下，岗梅根水提物能抑制甲1型流感病毒FM1株、腺病毒3型、合胞病毒RSV和副流感3型病毒，而岗梅茎水提物仅能抑制腺病毒3型及呼吸道合胞病毒RSV。结论：岗梅根、茎水提物均有一定的体外抗呼吸道病毒作用，岗梅根水提物体外对呼吸道病毒的抑制作用略优于岗梅茎。

岗梅根；岗梅茎；体外抗病毒；呼吸道病毒

岗梅为南方常用中草药，临床应用广泛，也是多种中成药和凉茶饮料的重要原料，临床多用于感冒发热、肺热咳嗽，热病津伤口渴，咽喉肿痛等病症[1]。据研究报道，岗梅提取物具有抗病毒和抗菌等多种药理活性[2-4]。

岗梅来源于冬青科植物梅叶冬青Ilexasprella(Hook.et Arn.)Champ.ex Benth.[5]，《中华人民共和国药典》2010版在附录部分规定岗梅的药用部位为“根”[6]，而《广东省中药材标准》(第一册)和《湖南省中药材标准》(2009年版)则收载岗梅的药用部位为“根和茎”[1，7]。目前市场上岗梅药材存在根、茎混用等现象，随着市场需求的日益增长，岗梅野生资源不断减少，若能以岗梅茎代替传统的岗梅根入药，将有利于扩大岗梅的药材来源，从而更好地保护药材资源。

本研究将通过实验比较岗梅根和茎水提物体外抗呼吸道病毒的作用效果，评价岗梅茎入药的合理性，从药效作用的角度为岗梅药材扩大药用部位提供科学参考。

1 材料

1.1 仪器和试剂

不锈钢立式电热蒸汽消毒器(上海三申医疗器械有限公司)；YJ-875医用净化工作台(苏州净化设备厂)；Hfsafe-1500A2型生物安全柜(上海力康)；8道移液器(百得)；20～200 μL移液器(赛默飞)。

小牛血清(广州蕊特生物科技有限公司，批号：090721)；DMEM培养基(GIBCO)；0.5%的鸡血红细胞溶液(自制)。

1.2 病毒和细胞株

甲1型流感病毒FM1株，于狗肾细胞(MDCK)传代，TCID50=4.67；呼吸道合胞病毒(RSV)long株，引进自美国ATCC(VR-26)，于人肺癌细胞(A549)中传代，TCID50=3.5；鼻病毒R14型，引进自ATCC(VR-284)；腺病毒3型，引进自广州医科大学呼吸道疾病研究所，均于人肺二倍体细胞(HEL)传代；副流感病毒3型，引进自广州医科大学呼吸道疾病研究所，于恒河猴肾细胞(LLC-MK2)上传代。

狗肾细胞(MDCK)，恒河猴肾细胞(LLC-MK2)，引进自广州医科大学呼吸道疾病研究所；人肺癌细胞(A549)，人肺二倍体细胞(HEL)，引进自昆明动物研究所。

以上病毒和细胞株均由广州中医药大学热带医学研究所病毒研究室冻存保种。

1.3 受试药物

1.3.1 岗梅根和岗梅茎水提物 取2013年1月采集于广东省平远县的野生岗梅根、茎各8 kg，分别以水提取，浓缩后得到相应的水提物浸膏，其中每克岗梅茎浸膏相当于生药8.78 g，每克岗梅根水提物相当于生药8.0 g。

分别精密称取岗梅茎、岗梅根水提物各0.1 mL，称重后分别为0.094 5 g、0.106 6 g。500 IU双抗处理过夜后，用DMEM培养基充分溶解。其中岗梅根水提物母液浓度为106.6 mg·mL-1，岗梅茎水提物母液浓度为94.5 mg·mL-1。实验时分别用培养基稀释到一定浓度。

1.3.2 阳性对照药 利巴韦林(原料药)，购自肇庆星湖药业有限公司，批号：20120523。实验时称取一定量的利巴韦林后用培养基充分溶解，将其配制成质量浓度为10 mg·mL-1的母液。实验时用培养基稀释到一定浓度。

2 方法

2.1 抗甲1型流感病毒FM1株实验

2.1.1 岗梅水提物在MDCK上毒性浓度的测定 浓度为1.0×105个·mL-1的MDCK以0.1mL/孔接种于96孔细胞培养板中，待细胞生长至紧密单层后，分别加入岗梅根水提物、茎水提物(50、12.5、3.12、0.78 mg·mL-1)和利巴韦林(2.0、0.5、0.125、0.031 mg·mL-1)，每个浓度4复孔，置于35 ℃培养箱中继续培养4 d。4 d后终止实验，以MTT法检测受试样品对细胞的毒性作用[8]。

2.1.2 岗梅水提物在MDCK上对流感病毒抑制作用的测定 浓度为1.0×105个·mL-1的MDCK以0.1 mL/孔接种于96孔细胞培养板中，待细胞生长至紧密单层后，弃上清液加入用含2%小牛血清的DMEM培养基稀释的各浓度药物0.1 mL，岗梅根水提物和茎水提物每个浓度接种4个复孔，同时攻击100TCID50的病毒悬液0.1 mL，于35 ℃吸附2 h后，弃上清液。重新加入相应浓度的含药培养基继续培养4 d。终止实验后，以鸡红血球凝集法判断待测样品对病毒的抑制作用。实验过程中同时设阳性药物利巴韦林对照、病毒对照和正常细胞对照[8]。

2.2 抗呼吸道合胞病毒实验

浓度为1×105个·mL-1的人肺癌细胞(A549)按0.1 mL/孔接种96孔细胞板，待细胞汇合紧密后，先用含2%小牛血清的DMEM培养基稀释受试样品，每个样品上4个梯度浓度。每个浓度接种4个细胞复孔，其中孔1、孔2观察岗梅水提物对细胞的毒性作用；孔3、孔4加药后同时攻击100TCID50病毒悬液100 μL。实验同时设置正常细胞对照、阳性药物利巴韦林对照及病毒对照。在35 ℃、5% CO2条件下培养4 d，终止实验[9]。

2.3 抗鼻病毒R14型和抗腺病毒3型实验

浓度为1×105个·mL-1人肺二倍体细胞(HEL)按0.1 mL/孔接种96孔细胞板，待细胞汇合紧密后，按照2.2项的方法，观察岗梅根、茎水提物对鼻病毒R14型和腺病毒3型的抑制作用。

2.4 抗副流感病毒3型实验

浓度为1×105个·mL-1恒河猴肾细胞(LLC-MK2)按0.1 mL/孔接种96孔细胞板，待细胞汇合紧密后，按照2.2项的方法，观察岗梅根、茎水提物对副流感病毒3型的抑制作用。

3 结果

3.1 抗甲1型流感病毒FM1株实验

3.1.1 岗梅水提物体外对狗肾细胞(MDCK)的毒性作用 经初步检测，岗梅根水提物在MDCK细胞上的半数毒性浓度为23.04 mg·mL-1，相当于生药184.32 mg·mL-1；岗梅茎水提物在MDCK细胞上的半数毒性浓度为10.82 mg·mL-1，相当于生药95.00 mg·mL-1。见表1。

3.1.2 岗梅水提物对病毒的抑制作用 在毒性浓度50 mg·mL-1浓度下，岗梅根水提物与岗梅茎水提物均能完全抑制流感病毒的血凝素，其岗梅根水提物在12.5 mg·mL-1浓度(

阳性药物利巴韦林在2.0～0.125 mg·mL-1浓度下对病毒具有完全抑制作用，而在最小实验浓度0.031 mg·mL-1下对流感病毒具有50%的抑制作用。见表2。

表1 岗梅水提物体外毒性浓度的测定结果(MTT，n=4)

表2 岗梅水提物体外对甲1流感病毒的抑制作用(鸡红血球凝集抑制法)

注：+++表示50%～75%鸡红血球发生凝集，表示病毒存在；++表示25%～50%的鸡红血球发生凝集，表示病毒存在；+表示小于25%的鸡红血球发生凝集，表示有一定量的病毒存在；-表示鸡红血球不发生凝集，表示药物对病毒有抑制作用。

3.2 岗梅水提物在A549细胞中对RSV的抑制作用

岗梅根水提物和岗梅茎水提物在最大实验浓度40 mg·mL-1下对A549细胞均无明显的毒性作用。

岗梅根水提物在无毒浓度40 mg·mL-1(相当于生药320 mg·mL-1)及20 mg·mL-1浓度(相当于生药浓度160 mg·mL-1)均能抑制呼吸道合胞病毒(RSV)的致细胞病变，其中40 mg·mL-1能完全抑制，而20 mg·mL-1能抑制90%的病毒。而岗梅茎在无毒浓度下40 mg·mL-1(相当于351.2 mg·mL-1)对RSV呼吸道合胞病毒有90%的抑制作用，而在20 mg·mL-1浓度下对呼吸道合胞病毒无抑制作用。阳性药物利巴韦林在2.0～0.125 mg·mL-1无毒浓度下对RSV均有完全抑制作用，而最小实验浓度0.031 mg·mL-1浓度下对RSV无抑制作用。见表3。

表3 岗梅水提物体外抗RSV实验结果(CPE法)

注：-为细胞生长正常，无病变出现；±为细胞病变少于整个单层细胞的10%；+为细胞病变约占整个单层细胞的25%；++为细胞病变约占整个单层细胞的50%；+++为细胞病变约占整个单层细胞的75%；++++为细胞病变约占整个单层细胞的75%以上；下同。

3.3 岗梅水提物在HEL细胞中对鼻病毒14型的抑制作用

岗梅根水提物最大实验浓度46.6 mg·mL-1(相当于372.8 mg·mL-1)对HEL细胞无明显毒性作用；岗梅茎水提物最大实验浓度55.05 mg·mL-1(相当于生药483.34 mg·mL-1)对细胞具有毒性作用，使细胞完全破碎，在27.52 mg·mL-1(相当于生药241.63 mg·mL-1)浓度下，对HEL细胞有20%的毒性作用。

岗梅根水提物和岗梅茎水提物的最大实验浓度均对鼻病毒14型无明显的抑制作用，不能抑制病毒致细胞病变作用，提示岗梅水提物对鼻病毒无效。

阳性药物利巴韦林在2.0～0.5 mg·mL-1无毒浓度下对鼻病毒14型具有较好的抑制作用，完全能抑制病毒的致细胞病变作用。见表4。

表4 岗梅水提物体外抗鼻病毒14型实验结果(CPE法)

3.4 岗梅水提物在HEL细胞中对腺病毒3型的抑制作用

岗梅根水提物最大实验浓度46.6 mg·mL-1(相当于372.8 mg·mL-1)对HEL细胞无明显毒性作用；岗梅茎水提物最大实验浓度55.05 mg·mL-1(相当于生药483.34 mg·mL-1)对细胞具有毒性作用，使细胞完全破碎，在27.52 mg·mL-1浓度下对细胞无明显毒性。岗梅根水提物在无毒浓度46.6 mg·mL-1和23.3mg·mL-1浓度下能完全抑制病毒，在11.65 mg·mL-1浓度下能抑制90%的病毒；岗梅茎水提物在毒性浓度55.05 mg·mL-1下和无毒浓度27.52 mg·mL-1下均能完全抑制病毒所致的细胞病变作用。阳性药物利巴韦林仅在最大实验浓度(无毒浓度)2.0 mg·mL-1对腺病毒3型有抑制作用。见表5。

3.5 岗梅水提物在LLC-MK2细胞中对副流感病毒3型的抑制作用

岗梅根水提物最大实验浓度50 mg·mL-1(相当于400 mg·mL-1)对LLC-MK2细胞无明显毒性作用；岗梅茎水提物最大实验浓度50 mg·mL-1(相当于生药439 mg·mL-1)对细胞具有毒性作用，使细胞完全破碎，在25 mg·mL-1浓度下(相当于生药219.5 mg·mL-1)对细胞无明显毒性。岗梅根水提物在无毒浓度50 mg·mL-1能完全抑制副流感病毒3型所致的细胞病变作用，而岗梅茎在无毒浓度25 mg·mL-1下对副流感3型的致细胞病变作用无明显抑制作用。阳性药物利巴韦林在无毒浓度5.0～1.0 mg·mL-1下均能完全抑制副流感3型病毒，而在0.25 mg·mL-1浓度下对副流感3型无抑制作用。见表6。

表5 岗梅水提物体外抗腺病毒3型实验结果(CPE法)

表6 岗梅水提物体外抗副流感病毒3型实验结果(CPE法)

4 讨论

呼吸道病毒是引起急性上呼吸道感染的主要病原体，其中包括流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒等，中药治疗呼吸道疾病历史悠久，现代研究表明中药及其成分具有抗病毒的药理活性[10]。岗梅是南方习用中草药，临床报道应用岗梅可有效治疗上呼吸道感染，药理学研究也发现岗梅提取物具有抗病毒作用[2，11]。针对岗梅药材入药标准不统一、根茎混用和药材供求关系日益紧张等情况，通过扩大岗梅药用部位将有助于解决岗梅的资源问题。因此本研究通过实验比较岗梅根和茎水提物体外抗呼吸道病毒的作用效果，评价岗梅茎入药的合理性。

实验结果表明，岗梅根与岗梅茎水提物在各种细胞毒性作用各不相同。其中在恒河猴肾细胞(LLC-MK2)和人胚肺细胞(HEL)上，岗梅茎水提物在同浓度下的毒性作用比岗梅根水提物大；而在狗肾细胞(MDCK)上情况正好相反。在人胚肺癌细胞(A549)上，岗梅根水提物与岗梅茎水提物最大实验浓度40 mg·mL-1对细胞均无明显毒性作用。

在甲1型流感病毒FM1株中，岗梅根在低毒浓度12.5 mg·mL-1浓度下能完全抑制甲1型流感病毒血凝素，对甲1型流感病毒FM1株有一定的抑制作用。

在合胞病毒实验中，岗梅茎水提物40 mg·mL-1、岗梅根水提物在20 mg·mL-1对A549细胞无毒且对呼吸道合胞病毒RSV具有较好的抑制作用。在腺病毒实验中，岗梅茎水提物在27.52 mg·mL-1(相当于生药浓度241.63 mg·mL-1)、岗梅根水提物在23.3 mg·mL-1(相当于生药浓度186.4 mg·mL-1)无毒浓度下对腺病毒3型均具有完全的抑制作用。在鼻病毒实验中，岗梅茎和岗梅根水提物在无毒浓度下两者对鼻病毒14型均无作用；在对副流感3型的实验中，岗梅根在50 mg·mL-1(相当于生药浓度400 mg·mL-1)无毒浓度下能完全抑制病毒致细胞病变作用，而岗梅茎对副流感3型无明显抑制作用。

岗梅根水提物能抑制甲1型流感病毒FM1株、腺病毒3型、合胞病毒RSV和副流感3型病毒，而岗梅茎水提物仅能抑制腺病毒3型及呼吸道合胞病毒RSV。岗梅根水提物体外对呼吸道病毒的抑制作用略优于岗梅茎。由于体外实验只能从一定角度反映药物的作用，尚需在后续研究中比较岗梅根、茎水提液的体内抗病毒作用。

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ComparativeStudyonEffectofIlexasprellaRootandStemagainstRespiratoryViruses

CHEN Weixuan1，2，HANZhengzhou1，2，YANGTiechui1，MAQing1，ZHANRuoting2，TANYing1*，CHENWeiwen2*，ZHANGFengxue3

(1.ChinaResourcesSanjiuMedical&PharmaceuticalCo.，Ltd.，Shenzhen518110，China；2.ResearchCenterofChineseHerbalResourcesandEngineeringofGuangzhouUniversityofChineseMedicine，KeyLaboratoryofChineseMedicineResourcesofMinistryofEducation，Guangzhou510006，China；3.TropicalMedicineInstitute，GuangzhouUniversityofChineseMedicine，Guangzhou510405，China)

Objective：To observe and compare the inhibitory effect ofIlexasprellaroot aqueous extract andI.asprellastem aqueous extract on several respiroviruses，in order to provide references for expansion ofI.asprella’smedicinal parts.Methods：MDCK，A549，HEL and LLC-MK2 cell were infected with influenza virus type A FM1 strain，RSV，rhinovirus type 14，adenovirus type 3，parainfluenza virus type 3 separately.The inhibitory effect ofI.asprellaroot aqueous extract andI.asprellastem aqueous extract on influenza virus type A FM1 strain was observed by using chicken hemagglutination method.And CPE was used to observe the inhibitory effect ofI.asprellaroot aqueous extract andI.asprellastem aqueous extract on RSV，rhinovirus type 14，adenovirus type 3，parainfluenza virus type 3.Results：At the nontoxic concentration，I.asprellaroot aqueous extract can inhibit influenza virus type A FM1 strain，RSV and parainfluenza virus type 3，whileI.asprellastem aqueous extract only inhibit adenovirus type 3 and RSV.Conclusion：BothI.asprellaroot aqueous extract andI.asprellastem aqueous extract can inhibit some of respiratory virusesinvitro.The inhibitory effect ofI.asprellaroot aqueous extract on respiratory virusesinvitrois better than that ofI.asprellastem aqueous extract.

Ilexasprellaroot，Ilexasprellastem，anti-respiratoryinvitro，respiratory viruses

2015-04-14)

“十二五”科技重大专项(2012ZX09201-201-001)；广东省科技计划项目(2012A030100006)

*

谈英，高级工程师，研究方向：创新中药研究与开发，E-mail：tanying@999.com.cn； 陈蔚文，教授，研究方向：创新中药研究与开发，E-mail：chenww@gzucm.edu.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.2.006